30686.乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)重組高分子量蛛絲蛋白高密度發(fā)酵

1、福建師范大學(xué)碩士學(xué)位論文乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)重組高分子量蛛絲蛋白高密度發(fā)酵姓名：鄭劍申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：微生物學(xué)指導(dǎo)教師：李敏20090601中文文摘中文文摘因為優(yōu)異的力學(xué)和生物學(xué)性能，蜘蛛絲已經(jīng)成為新一代高性能生物材料。目前研究人員已經(jīng)實現(xiàn)在大腸桿菌、酵母、植物、哺乳動物中等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)人造蛛絲蛋白，其中大腸桿菌系統(tǒng)因為遺傳背景清楚，可以高密度培養(yǎng)，有利于重組蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)，成為大量獲得人造蜘蛛絲的首選途徑。本室根據(jù)文獻(xiàn)報道蜘

2、蛛絲編碼基因特點，人工合成重組蛛絲蛋白基因序列，成功構(gòu)建和表達(dá)了重組蛛絲蛋白2聚體、8聚體、16聚體，并且已經(jīng)應(yīng)用于組織工程材料研究。為得到接近天然蜘蛛絲分子量的重組蛛絲蛋白材料，實驗室又構(gòu)建了重組蛛絲蛋白32聚體，表達(dá)重組蛛絲蛋白分子量為102KD，但因為重組蛛絲蛋白特殊的序列和較高的分子量，其在大腸桿菌中的表達(dá)量較低。本文在實驗室前期工作的基礎(chǔ)之上，通過優(yōu)化工程菌高密度生長和重組蛛絲蛋白32聚體高表達(dá)條件，提高了重組蛛絲蛋白產(chǎn)量，并

3、且初步摸索了重組蛛絲蛋白純化條件。一本研究的主要內(nèi)容：1首先將重組質(zhì)粒pNSR32分別轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS和BL21(DE3)兩株宿主菌，選擇適合表達(dá)的宿主菌。IPTG是乳糖操縱子最常用和十分有效的誘導(dǎo)劑，但其對產(chǎn)品帶來的毒性和昂貴的價格，使得在大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)醫(yī)用蛋白時，利用乳糖誘導(dǎo)更具優(yōu)勢，而且乳糖本身作為一種碳源可以被菌體利用，更容易達(dá)到菌體高密度培養(yǎng)的目的。由于采用乳糖作為誘導(dǎo)劑，菌體的生長和表達(dá)特性將有所改變，本文在

4、此基礎(chǔ)之上，優(yōu)化了適合工程菌生長和表達(dá)的培養(yǎng)基，在搖瓶培養(yǎng)條件下探索了適合工程菌生長和表達(dá)的條件，初步了解BL21(DE3)／pNSR32生長特性及表達(dá)規(guī)律，為工程菌10L罐高密度發(fā)酵條件優(yōu)化打下了基礎(chǔ)；2因為pH值、溶氧等因素很難在搖瓶中實現(xiàn)實時檢測和控制，搖瓶培養(yǎng)環(huán)境和實際發(fā)酵罐的培養(yǎng)環(huán)境相差很大，搖瓶培養(yǎng)結(jié)果也與發(fā)酵罐培養(yǎng)相差較大。本文首先采用分批發(fā)酵培養(yǎng)BL21(DE3)／pNSR32表達(dá)重組蛛絲蛋白，驗證了搖瓶培養(yǎng)條件，并且考