豬小腸抗菌肽分離鑒定及其生物活性研究.pdf

1、新鮮豬小腸經(jīng)充分破碎后,再經(jīng)高溫處理、乙酸浸提,最后經(jīng)Sephadex G-100和Sephadex G-25凝膠柱過濾層析,超濾離心管超濾后,收集各組分并用瓊脂糖彌散法檢測各組分的抗菌活性.具有抗菌活性的組分,經(jīng)Tricine SDS-PAGE分析為一條蛋白帶,分子量約為5972Da左右,得到電泳純的豬小腸抗菌肽,并進一步對分離純化的豬小腸抗菌肽的生物學(xué)功能進行了如下研究.采用瓊脂糖彌散實驗和活菌計數(shù)實驗檢測了豬小腸抗菌肽對雞大腸桿菌

2、O<,1> C83845株、雞白痢沙門氏菌C79-13株、E.coli O<,2>、E.coli O<,78>、豬致病性大腸桿菌的自然分離株、雞致病性大腸桿菌自然分離株、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌ATCC25923株、豬致病性沙門氏菌自然分離株、綠膿桿菌ATCC27853株、魚致病性嗜水氣單胞菌等11株細菌的作用.結(jié)果表明,豬小腸抗菌肽除對E.coli O<,2>和豬致病性沙門氏菌自然分離株作用較弱外,對以上其他9株菌株均有較強的抑制

3、或殺滅作用,殺菌率由59.5﹪~98.5﹪不等.揭示了該物質(zhì)具有較強的抗菌活性和較廣的抗菌譜.將雞大腸桿菌O<,1> C83845株、雞白痢沙門氏菌C79-13株和金黃色葡萄球菌ATCC25923株與豬小腸抗菌肽在室溫下作用15min.掃描電鏡下觀察豬小腸抗菌肽對這三株細菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn),豬小腸抗菌肽可作用于細菌,導(dǎo)致細菌表面出現(xiàn)囊泡樣或不規(guī)則突起樣結(jié)構(gòu),細菌嚴重變形、扭曲,表面變得粗糙,皺縮,胞膜破裂,內(nèi)容物外流而死亡.從而

4、可推斷該抗菌肽類物質(zhì)對細菌具有溶膜性作用,在一定程度上揭示了該物質(zhì)的抗菌機理.將IBV用豬小腸抗菌肽處理后再接種9日齡雞胚,測定雞胚尿囊液中的IBV血凝效價,并觀察雞胚病變.結(jié)果發(fā)現(xiàn),豬小腸抗菌肽可使雞胚尿囊液中IBV的血凝效價降低,同時還能抑制IBV所引起的雞胚病變.用豬小腸抗菌肽處理NDV和IBDV后再感染SPF雞,結(jié)果發(fā)現(xiàn),豬小腸抗菌肽可以降低ND和IBD的發(fā)病率和死亡率.表明豬小腸抗菌肽對IBV、NDV和IBDV等有一定的滅活作

5、用.給雛雞肌肉注射豬小腸抗菌肽后,定期測定雛雞腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)、免疫器官指數(shù)、ND弱毒苗及IBD中等毒力苗的血清抗體水平、生長指標與各段腸管腸絨毛長度、黏膜厚度、絨毛長度與隱窩深度比值(V/C),上皮內(nèi)淋巴細胞(IEL)、肥大細胞、杯狀細胞的數(shù)量以及腸道組織中IgA陽性物面積系數(shù).結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬小腸抗菌肽可提高雞腹腔巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù);提高免疫器官指數(shù);提高ND弱毒苗及IBD中等毒力苗的血清抗體水平;使腸道粘膜IEL、肥大

6、細胞和杯狀細胞數(shù)量以及腸道組織中的IgA陽性物面積系數(shù)顯著增加;可提高各段腸管腸絨毛長度和V/C值,但對腸黏膜厚度無顯著影響,實驗組雞的生長指標也較對照組明顯升高.另外,豬小腸抗菌肽也可以增強小鼠腹腔巨噬細胞LDH活性.這些結(jié)果表明豬小腸抗菌肽對雞特異性免疫與腸道粘膜免疫水平均有不同程度的提高作用;豬小腸抗菌肽還能促進雛雞生長發(fā)育,并從結(jié)構(gòu)上初步揭示了豬小腸抗菌肽促進生長發(fā)育的機理是使腸絨毛增長,改善了腸絨毛結(jié)構(gòu).該研究還利用化學(xué)交聯(lián)法