合浦珠母貝抗菌肽產(chǎn)生菌的篩選與初步應(yīng)用研究.pdf

1、合浦珠母貝(Pinctada fucata)是一種重要的海水養(yǎng)殖生產(chǎn)珍珠的母貝,復(fù)雜的的海洋生存環(huán)境及插入異物的特殊養(yǎng)殖過(guò)程等內(nèi)外因素都會(huì)使合浦珠母貝受到刺激,從而產(chǎn)生大量具有抗菌活性的物質(zhì)以增強(qiáng)免疫力。通過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化合浦珠母貝形成了特殊的體內(nèi)免疫機(jī)制,內(nèi)源性抗菌物質(zhì)豐富。研究表明,共附生的海洋微生物能產(chǎn)生與其宿主相同或相似的生理活性成分,這些活性物質(zhì)具有很大的開(kāi)發(fā)潛力。因此本文選取海南及深圳基地采集的合浦珠母貝,以其黏液作為原料分離篩

2、選抗菌肽產(chǎn)生菌,以期進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為天然食品防腐劑。本研究的主要內(nèi)容如下:
　　從海南及深圳水產(chǎn)養(yǎng)殖基地采集不同生長(zhǎng)階段的合浦珠母貝,以其黏液作為分離材料,稀釋涂布于六種不同的分離培養(yǎng)基,對(duì)合浦珠母貝樣品中共附生微生物進(jìn)行分離純化。將純化后的菌株在適當(dāng)條件下發(fā)酵并收集取上清液,利用牛津杯擴(kuò)散法對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸埃希氏

3、菌(Escherichia coli)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella)、痢疾志賀氏菌(Shigella dysenteriae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)這八種指示菌進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),篩選抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌。
　　對(duì)篩選出對(duì)抑菌能力強(qiáng)、抑菌譜廣的菌株發(fā)酵液抗菌物質(zhì)進(jìn)行酸類抑制作用

4、的排除、過(guò)氧化氫抑制作用的排除以及蛋白酶敏感性來(lái)篩選抗菌蛋白或多肽產(chǎn)生菌株。對(duì)通過(guò)篩選的抗菌肽產(chǎn)生菌株進(jìn)行菌株形態(tài)、生理生化及16S rDNA序列分析鑒定。研究溫度、pH及傳代次數(shù)等因素對(duì)該菌株的影響。
　　對(duì)選定菌株的的發(fā)酵液進(jìn)行粗提取,并研究其粗提取物的分子量范圍、抑菌譜、熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性等因素對(duì)其抑菌活性的影響。將粗提物應(yīng)用于羅非魚(yú)片的防腐保鮮,通過(guò)考察冷藏過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)、理化指標(biāo)以及感官評(píng)定對(duì)其抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

5、>　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明以3種不同地點(diǎn)采集的合浦珠母貝黏液為樣品,共分離得到127株菌株,其中具有抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌共31株,總體來(lái)看插核后的樣品中代謝產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)共附生菌比例高于插核前的樣品。從這31株抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生菌中篩選出的17株具有抑菌能力強(qiáng)、抑菌譜廣的菌株,經(jīng)過(guò)排除酸及過(guò)氧化氫的干擾作用實(shí)驗(yàn),以及四種蛋白酶酶解處理后,發(fā)現(xiàn)菌株SZAI09、SZAI17和SZAI35的發(fā)酵液中含有蛋白或多肽類抑菌成分,特別是菌株SZAI09抗菌

6、活性在酶解前后變化明顯。而且菌株SZAI09抗菌譜廣,抑菌能力強(qiáng),最終確定菌株SZAI09為優(yōu)良抗菌肽產(chǎn)生菌進(jìn)行進(jìn)一步研究。
　　根據(jù)菌株SZAI09菌落特征及生理生化結(jié)果初步鑒定為乳桿菌,其16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列中模式菌株Lactobacillus coryniformis subsp. torquens KCTC3535T序列相似性高達(dá)100％,確定菌株 SZAI09為棒狀乳桿菌(Lactobac

7、illus coryniformis)。菌株 SZAI09生物學(xué)特性研究表明菌株SZAI09具有的良好的遺傳穩(wěn)定性;最適生長(zhǎng)溫度為30℃;最適pH為7.0;通過(guò)該菌株的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)該菌的生長(zhǎng)速度較快,在接種后培養(yǎng)24h左右時(shí)菌量最多。
　　當(dāng)硫酸銨飽和度為60%時(shí),菌株 SZAI09發(fā)酵液析出的抗菌肽最多;該抗菌肽分子量主要集中在5000-10000Da范圍內(nèi),且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌都有抑菌作用,抑菌譜廣,其中對(duì)金黃色葡萄