合浦珠母貝微衛(wèi)星DNA標(biāo)記的篩選與養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析.pdf

1、合浦珠母貝（Pinctadafucata）廣泛分布于中國(guó)、日本、印度、澳大利亞等圍的熱帶和亞熱帶海區(qū)，是生產(chǎn)海水珍珠的主要貝類(lèi)之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)在合浦珠母貝育珠生產(chǎn)中，種苗繁育及養(yǎng)成過(guò)程等環(huán)節(jié)都出現(xiàn)了一系列問(wèn)題，其中種質(zhì)資源問(wèn)題尤為突出。為了促進(jìn)珍珠產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，合浦珠母貝的種質(zhì)保護(hù)和利用受到重視，不少單位已開(kāi)始進(jìn)行合浦珠母貝的良種培育研究。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展完善，分子標(biāo)記技術(shù)不僅用于遺傳多樣性調(diào)查和種群遺傳

2、結(jié)構(gòu)分析，也為種質(zhì)評(píng)價(jià)、鑒別、溯源提供了條件，同時(shí)，也為分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)體系的建立奠定了基礎(chǔ)。本研究以合浦珠母貝為研究材料，篩選合浦珠母貝的微衛(wèi)星引物，同時(shí)，利用篩選獲得的多態(tài)性位點(diǎn)對(duì)3個(gè)養(yǎng)殖群體的主要遺傳學(xué)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為合浦珠母貝的種質(zhì)資源保護(hù)和合浦珠母貝標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)資料。 1.合浦珠母貝微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選和評(píng)價(jià)本研究利用已發(fā)表文獻(xiàn)中的引物、EST文庫(kù)篩查法和構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)法3種方法開(kāi)發(fā)了合浦珠母貝微衛(wèi)星標(biāo)記。

3、借用已發(fā)表文獻(xiàn)中引物和EST文庫(kù)篩查法是最簡(jiǎn)便、耗費(fèi)最低的方法，合浦珠母貝目前發(fā)表的文獻(xiàn)中微衛(wèi)星引物數(shù)量較少，且同樣的引物在不同的地理種群中多態(tài)性有很大差別，這在很大程度上也限制了此法的應(yīng)用。EST文庫(kù)得到的微衛(wèi)星多態(tài)性較差，本研究中利用從EST文庫(kù)序列設(shè)計(jì)篩選出的32對(duì)引物中等位基因數(shù)目多為1-2個(gè)，多態(tài)性較差。構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)法是效果比較好的一種，本研究著重優(yōu)化發(fā)展的構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫(kù)法，用生物素標(biāo)記的（CA）15、（AG）12、

4、（ACA）15、（GATA）8、（GATT）75個(gè)探針進(jìn)行磁珠富集，隨機(jī)挑選500個(gè)克隆進(jìn)行PCR篩選，得到138（27.6％）個(gè)候選克隆，測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)130個(gè)克隆含有微衛(wèi)星重復(fù)單元。進(jìn)一步通過(guò)序列比對(duì)，最終獲得109個(gè)具有特異微衛(wèi)星序列的陽(yáng)性克隆，其中包含179個(gè)微衛(wèi)星DNA結(jié)構(gòu)域。獲得的微衛(wèi)星序列中屬于完全型序列的有154條，不完全型重復(fù)型序列有19條，復(fù)合型重復(fù)序列有6條。序列長(zhǎng)度為70-490bp，平均295bp。微衛(wèi)星核心序列

5、兩堿基重復(fù)3到39次，絕大多數(shù)序列重復(fù)次數(shù)大于10?；谖⑿l(wèi)星兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)并獲得了13對(duì)能夠在合浦珠母貝基因組有效擴(kuò)增的微衛(wèi)星引物。其中8對(duì)在種群中（n=32）具有擴(kuò)增多態(tài)性，其多態(tài)信息含量PIC值在0.239-0.787之間，平均為0.653；等位基因數(shù)在2-9個(gè)之間，平均為6.5個(gè)；觀測(cè)雜合度介于0.22-0.56之間，平均為0.43；期望雜合度的變化范圍為0.25-0.83，平均為0.69。 2.合浦珠母貝不同群體遺

6、傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析以合浦珠母貝廣東徐聞金碧公司養(yǎng)殖場(chǎng)、廣西北海營(yíng)盤(pán)鎮(zhèn)養(yǎng)殖場(chǎng)和南海水產(chǎn)研究所海南實(shí)驗(yàn)基地3個(gè)養(yǎng)殖群體為研究對(duì)象，利用8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8的引物進(jìn)行了遺傳多樣性和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，統(tǒng)計(jì)分析了等位基因數(shù)、基因頻率、雜合度、平均多態(tài)信息含量等遺傳參數(shù)，并檢測(cè)了群體是否符合Hardy-Weinberg平衡的狀況。結(jié)果顯示：8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在3個(gè)群體中共檢測(cè)到58個(gè)等位基因，觀測(cè)等位基因數(shù)在