合浦珠母貝微衛(wèi)星標(biāo)記的分離篩選及F2代家系的遺傳多樣性分析.pdf

1、合浦珠母貝(Pinctada fucata)是我國海水珍珠養(yǎng)殖的重要育珠貝,在我國海水珍珠產(chǎn)業(yè)中占有重要的位置。本研究利用FIASCO法進(jìn)行了新的微衛(wèi)星序列篩選,同時(shí)對實(shí)驗(yàn)室以前設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星引物、根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫的EST序列設(shè)計(jì)的引物以及文獻(xiàn)發(fā)表的引物進(jìn)行了篩選,然后利用篩選的有效引物對大亞灣隨機(jī)群體和F2家系進(jìn)行了遺傳變異分析,主要結(jié)構(gòu)如下:
　　1.微衛(wèi)星引物篩選。(1)采用生物素標(biāo)記的(AC)15探針和磁珠富集法構(gòu)

2、建合浦珠母貝基因組 DNA微衛(wèi)星富集文庫。隨機(jī)挑選2097個(gè)克隆進(jìn)行篩選,得到483個(gè)候選克隆(23.03％),對其中135個(gè)陽性克隆測序分析發(fā)現(xiàn)122個(gè)克隆含有微衛(wèi)星重復(fù)單元(90.37%)。進(jìn)一步通過序列比對,獲得65個(gè)具有特異微衛(wèi)星序列的陽性克隆(53.28%),其中包含85個(gè)微衛(wèi)星 DNA結(jié)構(gòu)域,其完美型(perfect)、非完美型(imperfect)和混合型(compound)分別占82.36%、8.24%和9.41%,重復(fù)

3、次數(shù)主要分布于5~20之間(95.74%),平均重復(fù)次數(shù)為7.83,(AC/GT)n重復(fù)所占比例最高(75.53%)。利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)了65對微衛(wèi)星引物,通過三亞養(yǎng)殖群體篩選,共獲得20個(gè)新的可穩(wěn)定擴(kuò)增的位點(diǎn),其中14個(gè)具多態(tài)性;20個(gè)新位點(diǎn)經(jīng) F2代家系篩選,19對穩(wěn)定擴(kuò)增;(2)對本實(shí)驗(yàn)室以前發(fā)表的多態(tài)引物進(jìn)行 F2代家系篩選,共獲得4個(gè)可穩(wěn)定擴(kuò)增的位點(diǎn);(3)對本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星引物進(jìn)行 F2代家系篩選

4、,共獲得35個(gè)可以穩(wěn)定擴(kuò)增的位點(diǎn);(4)對文獻(xiàn)中已發(fā)表引物進(jìn)行 F2代家系篩選,共獲得36個(gè)可以穩(wěn)定擴(kuò)增的位點(diǎn);(5)對 GeneBank中合浦珠母貝 EST序列設(shè)計(jì)18對微衛(wèi)星引物,并進(jìn)行 F2代家系篩選,共獲得11對新的可穩(wěn)定擴(kuò)增的位點(diǎn)。共獲得105個(gè)有效擴(kuò)增位點(diǎn)。這些位點(diǎn)可用于合浦珠母貝群體及家系的遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建等研究。
　　2.大亞灣群體的遺傳多樣性分析。利用上述20個(gè)位點(diǎn)中的5個(gè)對大亞灣隨機(jī)種群進(jìn)行了遺傳多

5、樣性分析,共檢測到29個(gè)等位基因,片段長度范圍為122~402 bp。各位點(diǎn)等位基因數(shù)2~9個(gè),平均等位基因數(shù)(A)5.8個(gè);有效等位基因數(shù)(Ae)為1.5957~5.6962,平均為2.9554;觀測雜合度(Ho)為0.3000~0.7000,平均0.4400;期望雜合度(He)為0.3797~0.8384,平均0.5737;多態(tài)性信息含量(PIC)為0.3573~0.8048,平均0.5204(>0.5)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,大亞灣群體的

6、遺傳多樣性非常豐富。
　　3. F2代家系遺傳多樣性分析。多樣性分析結(jié)果顯示,F2代家系 Shannon指數(shù)及 Nei's基因多樣性指數(shù)平均值分別為0.6433和0.4226,表明 F2代家系具有較高的遺傳多樣性。共105個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)用于F2代家系及其親本基因型的檢測,分析結(jié)果顯示,有72個(gè)位點(diǎn)在至少一個(gè)親本及子代中發(fā)生分離,多態(tài)位點(diǎn)比例高達(dá)68.57%。親本多態(tài)位點(diǎn)數(shù)占總有效擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的比例(68.57%)稍高于子代(67.62

7、%),表明 F2代家系的遺傳多樣性有所降低。遺傳相似度分析顯示,F2代家系與親本間的平均遺傳相似度為0.9722,家系個(gè)體間相似性指數(shù)位于0.6280~0.8836之間,平均0.7663。F2代家系與親本間的遺傳分化指數(shù)為 FST=0.0110。聚類分析結(jié)果顯示,F2代中72個(gè)個(gè)體和父母本聚為一大支,其余22個(gè)個(gè)體另聚為一大支,兩代中有14個(gè)個(gè)體(14.58%)兩兩聚為7支,其余82個(gè)體分別單獨(dú)聚群。研究結(jié)果表明,兩代家系間遺傳分化處于

8、低度水平,沒有明顯的遺傳分化。
　　4.標(biāo)記在親本及 F2代家系中的遺傳分離。根據(jù) Hardy-Weinberg平衡的卡方檢驗(yàn)(PHW),72個(gè)位點(diǎn)中有23個(gè)(31.94%)處于平衡狀態(tài)(PHW>0.05),其他49個(gè)位點(diǎn)(68.06%)都不同程度地偏離了平衡。?2檢驗(yàn)表明,23個(gè)標(biāo)記顯著偏離孟德爾遺傳分離比例(P<0.05,31.94%),其中15個(gè)偏分離位點(diǎn)表現(xiàn)為雜合子過剩、純合子缺失,另外7個(gè)偏分離位點(diǎn)表現(xiàn)為純合子過剩,而雜

9、合子不足,1個(gè)處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài);共有25個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在父本中發(fā)生分離,其中偏分離標(biāo)記數(shù)(4個(gè))占父本總分離標(biāo)記數(shù)的16%,有11個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記在母本中發(fā)生分離,偏分離標(biāo)記數(shù)(3個(gè))占母本總分離標(biāo)記數(shù)的27.27%,可見雄性偏分離標(biāo)記的比例明顯低于雌性,在性別間呈現(xiàn)了顯著差異。49個(gè)位點(diǎn)符合孟德爾遺傳分離比例,共得到父本特有標(biāo)記21個(gè),可用于雄性遺傳圖譜的構(gòu)建;母本特有標(biāo)記8個(gè),可用于雌性遺傳圖譜的構(gòu)建;父母本共享標(biāo)