乳酸菌IIa類抗菌肽PCR篩選方法初步研究.pdf

1、化學(xué)防腐劑在食品保藏中發(fā)揮重要作用,然而有些化學(xué)防腐劑對(duì)人體有潛在的危害,因此天然的食品防腐劑受到人們青睞。乳酸菌在自然界分布很廣泛,其常用于肉制品、發(fā)酵蔬菜、發(fā)酵乳制品的發(fā)酵與防腐,這是因?yàn)槿樗峋僧a(chǎn)生一些蛋白質(zhì)類物質(zhì),即抗菌肽。它在食品的防腐保鮮方面起重要作用。
　　目前研究較多的IIa類抗菌肽,其抑菌譜較為廣泛,具有較大潛力開(kāi)發(fā)成新型防腐劑。但目前大多數(shù)的抗菌肽篩選運(yùn)用傳統(tǒng)方法。該方法雖然有效,但它的篩選效率比較有限。隨著抗

2、菌肽的基因信息的不斷揭示,利用抗菌肽的保守序列進(jìn)行快速基因篩選已經(jīng)成為可能。
　　本研究根據(jù)不同種屬乳酸菌的抗菌肽的自身特點(diǎn),設(shè)計(jì)相應(yīng)種屬特異性引物,用于篩選抗菌肽產(chǎn)生菌。對(duì)目前已經(jīng)公布的50多株IIa類抗菌肽的基因信息進(jìn)行聚類分析,得到了7個(gè)組別的特定保守序列的抗菌肽類群,針對(duì)這些保守序列設(shè)計(jì)得到了8組引物。以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有保存的216株乳酸菌為篩選對(duì)象,依據(jù)抗菌肽的產(chǎn)生既存在于基因組DNA又存在于質(zhì)粒DNA中,故相繼提取了基因組和

3、質(zhì)粒DNA,用于抗菌肽的基因篩選。經(jīng)優(yōu)化PCR條件后,篩選到具有目標(biāo)條帶的菌株即疑似的產(chǎn)IIa抗菌肽的乳酸菌。為驗(yàn)證其序列的可靠性,故將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物連接到T載體中再進(jìn)行測(cè)序比對(duì),最后發(fā)現(xiàn)其基因序列與enterocinA的編碼基因的同源性為99％,說(shuō)明該菌攜帶enterocinA。為驗(yàn)證其真實(shí)的抑菌活性,采用雙層平板法做抑菌活力驗(yàn)證,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有一株乳酸菌對(duì)志賀氏菌和沙門氏菌有抑制活性。結(jié)果表明,本研究建立的PCR篩選方法,可用于II