光滑撲蟾(Xenopuslaevis)皮膚抗菌肽的篩選及其相關(guān)研究.pdf

1、抗菌肽( antibacterial peptides)是生物免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的一類(lèi)抵抗外界病原體感染的多肽,廣泛存在于昆蟲(chóng)、植物、動(dòng)物及人體內(nèi)。它除有非特異性的抗細(xì)菌、真菌、病毒等病原體外,還有抗腫瘤細(xì)胞的作用。特別是對(duì)多重耐藥菌和腫瘤細(xì)胞有殺傷作用,而不破壞人體的正常細(xì)胞,是一類(lèi)具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕?是目前抗病原微生物藥物開(kāi)發(fā)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。兩棲類(lèi)動(dòng)物皮膚光滑、裸露,沒(méi)有鱗片、甲殼和毛發(fā)的保護(hù),但能分泌具有良好保護(hù)作用的皮膚粘

2、液,皮膚粘液中含有大量分子結(jié)構(gòu)特殊、功能復(fù)雜多樣的抗菌活性物質(zhì),抗菌肽是其中最重要的生物活性物質(zhì)之一,是兩棲動(dòng)物機(jī)體先天防御系統(tǒng)的重要組成部分。
　　本研究以光滑爪蟾、中國(guó)林蛙,東北林蛙和中華大蟾蜍為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)兩種誘導(dǎo)方式提取這四種兩棲動(dòng)物的皮膚分泌液,進(jìn)行了一系列的生物活性測(cè)定。結(jié)果表明,不同種類(lèi)的兩棲動(dòng)物皮膚分泌液生物活性并不相同,不同方法誘導(dǎo)所提取的同一類(lèi)兩棲動(dòng)物的皮膚分泌液的生物活性也有差異。體外抑菌活性檢測(cè)結(jié)果表明,

3、四種兩棲動(dòng)物皮膚分泌物對(duì)不同菌株均產(chǎn)生不同程度的抑菌效果,其中以光滑爪蟾的抑菌效果最強(qiáng),除此之外,光滑爪蟾皮膚分泌物還有抑制和殺傷癌細(xì)胞的作用,并具有胰酶抑制劑活性和極其微弱的溶血活性。
　　基于上述結(jié)果,以光滑爪蟾為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)不同方法分離皮膚分泌物中的抗菌肽,并對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能做進(jìn)一步研究。通過(guò)四步分離純化:SephadexG-25凝膠過(guò)濾層析、制備型反相高壓液相層析、離子交換層析和分析型反相高效液相色譜層析,分離純化出兩種抗

4、菌肽:AMP-1和AMP-2,通過(guò)氨基酸N端測(cè)序和MALDI-TOF/TOF-MS人工De nove手動(dòng)拼接兩種方法相結(jié)合的方式對(duì)抗菌肽 AMP-1和AMP-2的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。網(wǎng)上搜庫(kù)序列比對(duì)后,確定本實(shí)驗(yàn)所獲得的兩種抗菌肽均為首次發(fā)現(xiàn)。對(duì)兩種新發(fā)現(xiàn)的抗菌肽進(jìn)行最小抑菌濃度( MIC)檢測(cè)、胰蛋白酶抑制活性檢測(cè)、溶血活性檢測(cè)和抗腫瘤活性檢測(cè)。結(jié)果顯示: AMP-1和AMP-2對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有抗菌活性,AMP-2還對(duì)綠

5、膿桿菌也有較弱的抗菌活性,并且AMP-1和AMP-2對(duì)多種耐藥菌株也具有不同程度微生物來(lái)源不可能與兩棲類(lèi)動(dòng)物生存環(huán)境的微生物譜系相同,還可能由于我們所檢測(cè)的微生物與特定抗菌肽的天然靶向微生物存在差異,因此導(dǎo)致我們沒(méi)有檢測(cè)到抗菌肽對(duì)個(gè)別菌株的抗菌活性。除抗菌活性外,AMP-1和AMP-2均有較強(qiáng)的胰蛋白酶抑制活性,同時(shí)也表現(xiàn)出了極其微弱的溶血活性?？鼓[瘤結(jié)果顯示:AMP-1并沒(méi)有殺傷癌細(xì)胞的作用,而AMP-2卻表現(xiàn)出了很好的抗腫瘤的效果,

6、當(dāng)樣品濃度達(dá)到146.6Ug/ml時(shí),AMP-2可以殺死81.1％人乳腺癌細(xì)胞MCF-7。
　　為了進(jìn)一步研究這兩種抗菌肽的結(jié)構(gòu)與功能,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)ExPASy網(wǎng)站上的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件Jpred對(duì)其進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),通過(guò)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件 CPHmodels對(duì)其進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。以此為基礎(chǔ),通過(guò)替換和缺失AMP-1中賴(lài)氨酸對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,又得到九條新的抗菌肽。同時(shí)在NCBI中進(jìn)行搜索,找到與AMP-1和AMP-2序列相似的抗菌肽,

7、并利用多肽固相合成的方法合成16條抗菌肽。將合成的多肽通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行純化,共得到5條純度在99％以上,8條純度在95％以上的抗菌肽。以金黃色葡萄球菌為指示菌,檢測(cè)13條純品抗菌肽的抗菌活性,結(jié)合預(yù)測(cè)結(jié)果推測(cè)抗菌肽AMP-1中每個(gè)賴(lài)氨酸對(duì)抗菌肽的結(jié)構(gòu)以及抗菌活性的作用。由于抗菌肽一般都是含有一螺旋結(jié)構(gòu)的兩親性分子,疏水性及帶電荷數(shù)對(duì)其生物活性影響非常大。因此,單一的氨基酸突變就可能很大程度上改變抗菌肽的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。在對(duì)抗菌

8、肽AMP-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的過(guò)程中,我們又獲得了四條新的具有抗菌活性的抗菌肽。
　　為了進(jìn)一步闡明光滑爪蟾抗菌肽的殺菌機(jī)理,將E.coli ATCC25922與S.aureus ATCC25923菌株分別與光滑爪蟾抗菌肽AMP-1和AMP-2共孵育后進(jìn)行透射電鏡觀(guān)察分析,光滑爪蟾抗菌肽對(duì)細(xì)菌形態(tài)及細(xì)菌表面結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示:處理前兩者具有完整的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,并且其細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、表面光滑,能觀(guān)察到完整的菌毛,細(xì)胞表面沒(méi)有損傷。細(xì)胞

9、內(nèi)的蛋白質(zhì)和DNA等物質(zhì)能與染色液中所含有的處金屬離子結(jié)合而使菌體呈現(xiàn)深黑色。經(jīng)過(guò)抗菌肽AMP-1和AMP-2處理后,E.coli ATCC25922和S.aureus ATCC25923均有部分細(xì)胞內(nèi)容物外泄,細(xì)胞出現(xiàn)破損或腫脹,菌體部分或完全破裂,并伴有細(xì)胞質(zhì)稀釋的現(xiàn)象,細(xì)胞表面存在破損成小孔的地方,細(xì)胞膜界限模糊不清,甚至細(xì)胞膜完全溶解。由于細(xì)胞內(nèi)容物外滲,細(xì)胞質(zhì)解體,形成空腔,致使被染色的細(xì)胞顏色變淺。以上結(jié)果表明,抗菌肽AMP

10、-1和AMP-2能夠使E.coli ATCC25922、S.aureus ATCC25923菌體細(xì)胞壁破裂或者在細(xì)胞表面形成孔洞,內(nèi)容物外泄,最終導(dǎo)致菌體死亡。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)從光滑爪蟾皮膚分泌物中分離純化出兩種新的抗菌肽AMP-1和AMP-2,兩種抗菌肽都具有廣譜抗菌活性,胰蛋白酶抑制活性,微弱的溶血活性。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后對(duì)抗菌肽AMP-1進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,又獲得四種新的具有抗菌活性的抗菌肽AMP-1-2、AMP-1-3、AMP-1-4