藏豬腸道中拮抗致病菌微生物的篩選及其抗菌肽研究.pdf

1、抗生素的發(fā)明和使用，對(duì)人類和動(dòng)物疾病防控發(fā)揮了極其重要的作用，但其廣泛而超標(biāo)應(yīng)用導(dǎo)致了抗藥菌株的產(chǎn)生，給人類和動(dòng)物的健康造成極大的威脅。因而，研究和篩選抗生素的替代品成為國(guó)內(nèi)外生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。在眾多研究中發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有廣譜抗菌活性，對(duì)各種有害微生物、真菌、病毒的危害和腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生等均有很好的防控效果，而且很少產(chǎn)生耐藥性，因而受到國(guó)內(nèi)外研究者的高度青睞。
　　藏豬又稱為藏香豬，是我國(guó)青藏高原上常年放牧生長(zhǎng)的寶貴地方品種，在長(zhǎng)

2、期嚴(yán)酷的自然環(huán)境條件下，形成了珍貴的抗寒、抗病、食草、肉香等優(yōu)良特性，這些寶貴的優(yōu)良特性必然與其腸道特殊的微生物區(qū)系有關(guān)，其腸道中存在的多種大量微生物群落相互拮抗又相互促進(jìn)共生，為藏豬腸道提供了優(yōu)良的微生態(tài)環(huán)境，分泌的各種維生素及多肽、蛋白等，發(fā)揮了促進(jìn)健康和預(yù)防疾病的功能，同時(shí)，也為拮抗菌和抗菌物質(zhì)的篩選提供了來源?；诖?，我們以藏豬腸道微生物為研究對(duì)象，采取多種現(xiàn)代先進(jìn)的生物技術(shù)，研究藏豬腸道內(nèi)容物中是否存在拮抗病原菌的微生物，以及

3、能否從篩選的拮抗菌中分離出有效的抑菌物質(zhì)，如抗菌肽等。通過以下系列研究，獲得如下試驗(yàn)結(jié)果:
　　1、采用瓊脂擴(kuò)散法從藏豬的盲腸內(nèi)容物中篩選出一株拮抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性最強(qiáng)的細(xì)菌，經(jīng)過對(duì)該菌株進(jìn)行菌落觀察、美藍(lán)染色鑒定以及16S rDNA的比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，判定該菌株為枯草芽孢桿菌，并命名為Bacillus sublitis TS;發(fā)酵條件優(yōu)化分析表明，最佳碳源為2％的玉米粉，最佳發(fā)酵起始pH值為6，最佳培養(yǎng)溫度為

4、30℃，接種后發(fā)酵至24h時(shí)其抑菌活性最高，抑菌物質(zhì)的產(chǎn)量最高。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該菌發(fā)酵上清液具有不耐熱、不耐蛋白酶K的特點(diǎn)，而且在中性環(huán)境下，抑菌活性最高。
　　2、采用AKTA蛋白純化系統(tǒng)及反相液相色譜系統(tǒng)，利用不同規(guī)格的反相液相色譜柱，包括ResourceTM RPC(3 mL)、Ultisil XB-C8、ZORBAX300SB-C18色譜柱，結(jié)合超濾濃縮裝置，逐步將分離篩選的拮抗菌種Bacillus sublitis TS發(fā)酵

5、產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，得到了一種新型的天然抗菌肽TP（Tibetan-swine derived peptide）。其質(zhì)譜分析表明，該純化抗菌肽包含16個(gè)氨基酸，序列為ASVVNKLTGGVAGLLK，分子質(zhì)量為1568.919 Da。在APD數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)與其相同的氨基酸序列，因此命名為新型抗菌肽TP，在線預(yù)測(cè)顯示其帶有兩個(gè)正電荷，疏水性氨基酸比例為50％，等電點(diǎn)為10，分子式為C68H124N18O20S0。另外，TP的

6、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果各異，可能形成螺旋結(jié)構(gòu)，疏水氨基酸和親水氨基酸分別分布在螺旋結(jié)構(gòu)的兩面，也可能形成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，其確定的結(jié)構(gòu)形式仍需做進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　3、采用MH瓊脂平板法，研究了抗菌肽TP對(duì)多種G+和G-細(xì)菌的抑制效果，結(jié)果以最小抑菌濃度(MIC)表示。研究結(jié)果表明，TP的敏感菌株多為革蘭氏陰性菌，陽性菌的敏感性較弱。以E.coli ATCC25922為模型，探究了抗菌肽TP對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)抑制的動(dòng)態(tài)作用效果。在一定范圍內(nèi)，其作

7、用時(shí)間越久，濃度越高，抑制效果越好，但對(duì)抑制大腸桿菌的傳統(tǒng)多肽多粘菌素相比活性仍然較弱。TP處理E.coli ATCC25922后發(fā)現(xiàn):
　　(1)在掃描電鏡下觀察，細(xì)胞表面完整性受到破壞;
　　(2)鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)可以攝入細(xì)胞內(nèi)，產(chǎn)生鄰-硝基苯酚(ONP)，表明TP可以增強(qiáng)E.coli ATCC25922的細(xì)胞膜滲透性;
　　(3)滲出細(xì)胞外的K+濃度增加，進(jìn)一步證明了其滲透性增強(qiáng)，細(xì)胞膜結(jié)

8、構(gòu)被破壞。另外，體外競(jìng)爭(zhēng)吸附試驗(yàn)表明，抗菌肽TP可以與EtBr競(jìng)爭(zhēng)E.coli ATCC25922基因組DNA堿基結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合力比EtBr對(duì)DNA的結(jié)合力更強(qiáng)。表明抗菌肽TP在殺菌過程中，增加細(xì)胞膜通透性，破壞膜結(jié)構(gòu)，并有可能進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞，結(jié)合胞內(nèi)的DNA，使其DNA活性受阻。
　　4、為檢驗(yàn)TP對(duì)紅細(xì)胞的毒性，采用細(xì)胞溶血性分析方法，檢驗(yàn)抗菌肽TP對(duì)小鼠紅細(xì)胞的毒性。結(jié)果表明，TP在320μM濃度下仍然有15％左右的溶血性，但

9、與對(duì)照組PBS處理的溶血性相比差異不顯著，而極顯著低于1％ Triton X-100處理后的溶血性(100％)(p＜0.01)。MTT分析結(jié)果表明，TP對(duì)原代絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞的IC50=71.323μM的濃度比TP最敏感菌株的MIC(2.5-10μM)都要高。TP抑制人胃癌細(xì)胞系MKN-45和急性早幼粒白血病細(xì)胞系NB4的IC50濃度分別為4.686μM和11.479μM。NB4細(xì)胞使用TP處理后，提取RNA并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，其癌