源于植物乳桿菌的抗菌肽Lac-B23的篩選、分離純化及抗菌特性的研究.pdf

1、食品在加工保藏過程中，防腐保鮮是保障食品安全的重要手段。乳酸菌抗菌肽因其具有無毒、無殘留和高效的特點(diǎn)，并可有效抑制或殺滅食品中腐敗和致病微生物，因此可代替化學(xué)防腐劑。Nisin是目前唯一批準(zhǔn)應(yīng)用在食品工業(yè)中的抗菌肽，但因抑菌譜窄以及分散性差等缺點(diǎn)限制了其廣泛應(yīng)用，所以新型天然抗菌肽的發(fā)掘已成為生物防腐劑研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。本研究從實(shí)驗(yàn)室中保存的乳酸菌菌株中篩選得到能夠產(chǎn)生穩(wěn)定抑菌作用的Lactobacillus plantarum B2

2、3，研究分析確定其產(chǎn)物中具有抑菌作用的的肽類物質(zhì)為Lac-B23，采用不同分離方法對Lac-B23進(jìn)行純化，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和蛋白酶穩(wěn)定性等抗菌特性，具體研究結(jié)果如下：
　　采用瓊脂擴(kuò)散法從300株乳酸菌進(jìn)行篩選出具有抑菌作用的6株乳酸菌，其中有一株菌對單增李斯特和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌活性。通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)16S rDNA和API生理生化鑒定，確定該菌為Lactobacillus planta

3、rum，近緣性在99％以上，已提交Genebank，登錄號為KC292491.1。通過排除過氧化氫實(shí)驗(yàn)以及蛋白類物質(zhì)確定的實(shí)驗(yàn)說明產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是抗菌肽。
　　采用三步法分離純化抗菌肽Lac-B23。粗提階段通過硫酸銨分級沉淀確定80%飽和度硫酸銨為最佳濃度，比細(xì)胞吸附解析法可以得到更高含量的Lac-B23。經(jīng)細(xì)胞吸附解析后透析液再經(jīng)陽離子交換層析后純化倍數(shù)達(dá)到了796.54，得率為2.76%。80%硫酸銨沉淀再經(jīng)陽離子交換層析后

4、的純化倍數(shù)達(dá)到827.01，得率為11.36%。精度純化階段采用高效液相法分離純化，在25min左右都出現(xiàn)了單一的峰，所以可以說明抗菌肽Lac-B23會在25min左右被洗脫下來。用Tricine SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lac-B23的分子量為6.73kDa，而且該條帶有明顯的抑菌活性。經(jīng)過LC-MS進(jìn)一步分析鑒定，表明Lac-B23可能是一種新型的肽類。
　　Lac-B23抑菌特性實(shí)驗(yàn)表明，Lactobacillus p

5、lantarum B23發(fā)酵時(shí)間在16h時(shí)OD600最高，抗菌肽抑菌活性最強(qiáng)。在pH4.0~12.0之間Lac-B23有著非常穩(wěn)定的pH耐受性；在25~121℃之間都有抑菌活性，在90℃后，抑菌活性有明顯的下降；木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對Lac-B23不起作用，而蛋白酶K、蛋白酶E和胰蛋白酶可以使Lac-B23降解。K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+及Cu2+的添加使得抗菌肽Lac-B23活力降低，F(xiàn)e2+和Mn2+的添加促使抑菌活性增強(qiáng)。