源于植物乳桿菌的抗菌肽Lac-B23的篩選、分離純化及抗菌特性的研究.pdf

1、食品在加工保藏過程中，防腐保鮮是保障食品安全的重要手段。乳酸菌抗菌肽因其具有無毒、無殘留和高效的特點，并可有效抑制或殺滅食品中腐敗和致病微生物，因此可代替化學防腐劑。Nisin是目前唯一批準應用在食品工業(yè)中的抗菌肽，但因抑菌譜窄以及分散性差等缺點限制了其廣泛應用，所以新型天然抗菌肽的發(fā)掘已成為生物防腐劑研究領域的熱點之一。本研究從實驗室中保存的乳酸菌菌株中篩選得到能夠產生穩(wěn)定抑菌作用的Lactobacillus plantarum B2

2、3，研究分析確定其產物中具有抑菌作用的的肽類物質為Lac-B23，采用不同分離方法對Lac-B23進行純化，在此基礎上進一步研究其酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和蛋白酶穩(wěn)定性等抗菌特性，具體研究結果如下：
　　采用瓊脂擴散法從300株乳酸菌進行篩選出具有抑菌作用的6株乳酸菌，其中有一株菌對單增李斯特和金黃色葡萄球菌有較強的抑菌活性。通過形態(tài)學、分子生物學16S rDNA和API生理生化鑒定，確定該菌為Lactobacillus planta

3、rum，近緣性在99％以上，已提交Genebank，登錄號為KC292491.1。通過排除過氧化氫實驗以及蛋白類物質確定的實驗說明產生的抑菌物質是抗菌肽。
　　采用三步法分離純化抗菌肽Lac-B23。粗提階段通過硫酸銨分級沉淀確定80%飽和度硫酸銨為最佳濃度，比細胞吸附解析法可以得到更高含量的Lac-B23。經細胞吸附解析后透析液再經陽離子交換層析后純化倍數達到了796.54，得率為2.76%。80%硫酸銨沉淀再經陽離子交換層析后

4、的純化倍數達到827.01，得率為11.36%。精度純化階段采用高效液相法分離純化，在25min左右都出現了單一的峰，所以可以說明抗菌肽Lac-B23會在25min左右被洗脫下來。用Tricine SDS-PAGE實驗結果發(fā)現，Lac-B23的分子量為6.73kDa，而且該條帶有明顯的抑菌活性。經過LC-MS進一步分析鑒定，表明Lac-B23可能是一種新型的肽類。
　　Lac-B23抑菌特性實驗表明，Lactobacillus p

5、lantarum B23發(fā)酵時間在16h時OD600最高，抗菌肽抑菌活性最強。在pH4.0~12.0之間Lac-B23有著非常穩(wěn)定的pH耐受性；在25~121℃之間都有抑菌活性，在90℃后，抑菌活性有明顯的下降；木瓜蛋白酶和胃蛋白酶對Lac-B23不起作用，而蛋白酶K、蛋白酶E和胰蛋白酶可以使Lac-B23降解。K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+及Cu2+的添加使得抗菌肽Lac-B23活力降低，Fe2+和Mn2+的添加促使抑菌活性增強。