皺紋盤(pán)鮑(Haliotis discus hannai)C型凝集素的分子克隆、蛋白重組和活性分析.pdf

1、皺紋盤(pán)鮑是我國(guó)主要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一。近年來(lái)病害頻發(fā)等問(wèn)題，使皺紋盤(pán)鮑養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大的損失，對(duì)其可持續(xù)性發(fā)展構(gòu)成了威脅。深入了解皺紋盤(pán)鮑的免疫機(jī)制，研究防御病害的有效方法，是目前亟待解決的問(wèn)題。皺紋盤(pán)鮑缺乏獲得性免疫，在抵御外源微生物入侵時(shí)主要依靠固有免疫。C型凝集素作為一種重要的模式識(shí)別受體，能夠識(shí)別和清除多種外源微生物，在皺紋盤(pán)鮑的免疫防御中發(fā)揮著重要的作用。
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)克隆得到了一個(gè)皺紋盤(pán)鮑 C型

2、凝集素基因（HdCTL），并對(duì)其序列進(jìn)行了生物學(xué)分析；檢測(cè)了 HdCTL在皺紋盤(pán)鮑各組織中的分布，及其受到外源微生物后在皺紋盤(pán)鮑血細(xì)胞中的表達(dá)規(guī)律；構(gòu)建了以Transetta感受態(tài)細(xì)胞為表達(dá)載體的原核表達(dá)系統(tǒng)，重組得到了rHdCTL蛋白，并對(duì)rHdCTL進(jìn)行了活性分析；旨在初步探索HdCTL在皺紋盤(pán)鮑免疫防御中發(fā)揮的作用，為進(jìn)一步了解其固有免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　本研究獲得了皺紋盤(pán)鮑 C型凝集素 HdCTL編碼基因的cDNA，

3、其全長(zhǎng)為1933bp，包括5’端非編碼區(qū)（UTR）9bp，3’端UTR430bp，在3’端具有多聚腺苷酸加尾信號(hào)AATAAA,開(kāi)放閱讀框（ORF）1494bp，共編碼497個(gè)氨基酸。ExPASy預(yù)測(cè)其理論等電點(diǎn)為7.15，分子量為56.14kDa。所編碼的氨基酸序列1（M）-25（F）為信號(hào)肽，31（R）-153（F）為CLECT結(jié)構(gòu)域，196（W）-463（C）為Zona-pellucida結(jié)構(gòu)域，經(jīng)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)HdCTL編碼

4、氨基酸含有C型凝集素結(jié)構(gòu)域。
　　利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了HdCTL在皺紋盤(pán)鮑各組織的表達(dá)規(guī)律和經(jīng)外源微生物刺激后 HdCTL在血細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)量。結(jié)果表明 HdCTL在肌肉、外套膜、鰓、血細(xì)胞、肝和性腺中都有表達(dá)，且在肌肉中的表達(dá)量最高，其次是血細(xì)胞，在鰓中的表達(dá)量最低。經(jīng)鰻弧菌和藤黃微球菌刺激后，HdCTL在血細(xì)胞中的表達(dá)量出現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)；在受到鰻弧菌刺激6h后，表達(dá)量顯著上升；在24h表達(dá)量達(dá)到峰值；48h時(shí)表達(dá)量

5、下降到最低。藤黃微球菌刺激后，也表現(xiàn)出被誘導(dǎo)表達(dá)的趨勢(shì)。刺激6h后表達(dá)量顯著升高；12h表達(dá)量下降，但在24h時(shí)顯著升高而且達(dá)到峰值，高表達(dá)一直持續(xù)到48h。所以HdCTL可能參與了皺紋盤(pán)鮑體內(nèi)的免疫防御過(guò)程，在抵御不同外源微生物入侵過(guò)程中發(fā)揮作用。
　　將HdCTL編碼區(qū)成熟肽克隆入Peasy-E1表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入Transetta表達(dá)系統(tǒng)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用鎳螯合瓊脂糖凝膠色譜法純化出rHdCTL重組蛋白，并利用梯

6、度稀釋法對(duì)重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，經(jīng)復(fù)性蛋白免疫小白鼠，收集抗血清獲得了抗rHdCTL多克隆抗體，利用western-bolt對(duì)抗體進(jìn)行特異性分析，結(jié)果顯示抗rHdCTL多克隆抗體能特異性識(shí)別rHdCTL。
　　酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)了rHdCTL對(duì)mannan、zymosan、LPS、PGN和β-glucan五種 PAMPs的體外結(jié)合能力。rHdCTL可以體外結(jié)合 mannan和zymosan，對(duì)于zymosan的結(jié)合活性隨

7、著重組蛋白濃度的增加而增強(qiáng)，而對(duì)于LPS、PGN和β-glucan均無(wú)結(jié)合能力。這些結(jié)果說(shuō)明HdCTL編碼蛋白可能介導(dǎo)皺紋盤(pán)鮑對(duì)于mannan和zymosan的免疫識(shí)別作用。
　　進(jìn)一步研究了rHdCTL對(duì)于外源微生物的凝集活性。發(fā)現(xiàn)rHdCTL對(duì)假絲酵母菌和畢赤酵母菌具有凝集活性，推測(cè)對(duì)mannan和zymosan識(shí)別是其凝集真菌等微生物的分子基礎(chǔ)，表明HdCTL可作為模式識(shí)別受體參與皺紋盤(pán)鮑對(duì)于外源微生物的免疫識(shí)別和免疫應(yīng)答作

8、用。
　　檢測(cè)了 rHdCTL對(duì)皺紋盤(pán)鮑血細(xì)胞吞噬作用和包囊化的促進(jìn)作用。rHdCTL能夠促進(jìn)皺紋盤(pán)鮑血細(xì)胞對(duì)于外源微生物的吞噬作用。利用鎳瓊脂糖顆粒檢測(cè)rHdCTL對(duì)皺紋盤(pán)鮑血細(xì)胞包囊化的促進(jìn)作用中發(fā)現(xiàn)，表面包被了rHdCTL的鎳瓊脂糖顆粒能夠促進(jìn)皺紋盤(pán)鮑血細(xì)胞在體外對(duì)瓊脂糖顆粒的包囊化作用，這些結(jié)果表明rHdCTL可能參與皺紋盤(pán)鮑對(duì)于外源微生物清除過(guò)程。
　　綜上所述，本研究克隆得到了一個(gè)皺紋盤(pán)鮑C型凝集素HdCTL，并