皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)C型凝集素的分子克隆、蛋白重組和活性分析.pdf

1、皺紋盤鮑是我國主要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟貝類之一。近年來病害頻發(fā)等問題，使皺紋盤鮑養(yǎng)殖業(yè)蒙受了巨大的損失，對其可持續(xù)性發(fā)展構(gòu)成了威脅。深入了解皺紋盤鮑的免疫機制，研究防御病害的有效方法，是目前亟待解決的問題。皺紋盤鮑缺乏獲得性免疫，在抵御外源微生物入侵時主要依靠固有免疫。C型凝集素作為一種重要的模式識別受體，能夠識別和清除多種外源微生物，在皺紋盤鮑的免疫防御中發(fā)揮著重要的作用。
　　本實驗運用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)克隆得到了一個皺紋盤鮑 C型

2、凝集素基因（HdCTL），并對其序列進行了生物學分析；檢測了 HdCTL在皺紋盤鮑各組織中的分布，及其受到外源微生物后在皺紋盤鮑血細胞中的表達規(guī)律；構(gòu)建了以Transetta感受態(tài)細胞為表達載體的原核表達系統(tǒng)，重組得到了rHdCTL蛋白，并對rHdCTL進行了活性分析；旨在初步探索HdCTL在皺紋盤鮑免疫防御中發(fā)揮的作用，為進一步了解其固有免疫機制提供理論依據(jù)。
　　本研究獲得了皺紋盤鮑 C型凝集素 HdCTL編碼基因的cDNA，

3、其全長為1933bp，包括5’端非編碼區(qū)（UTR）9bp，3’端UTR430bp，在3’端具有多聚腺苷酸加尾信號AATAAA,開放閱讀框（ORF）1494bp，共編碼497個氨基酸。ExPASy預(yù)測其理論等電點為7.15，分子量為56.14kDa。所編碼的氨基酸序列1（M）-25（F）為信號肽，31（R）-153（F）為CLECT結(jié)構(gòu)域，196（W）-463（C）為Zona-pellucida結(jié)構(gòu)域，經(jīng)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)HdCTL編碼

4、氨基酸含有C型凝集素結(jié)構(gòu)域。
　　利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測了HdCTL在皺紋盤鮑各組織的表達規(guī)律和經(jīng)外源微生物刺激后 HdCTL在血細胞內(nèi)的表達量。結(jié)果表明 HdCTL在肌肉、外套膜、鰓、血細胞、肝和性腺中都有表達，且在肌肉中的表達量最高，其次是血細胞，在鰓中的表達量最低。經(jīng)鰻弧菌和藤黃微球菌刺激后，HdCTL在血細胞中的表達量出現(xiàn)明顯上升的趨勢；在受到鰻弧菌刺激6h后，表達量顯著上升；在24h表達量達到峰值；48h時表達量

5、下降到最低。藤黃微球菌刺激后，也表現(xiàn)出被誘導(dǎo)表達的趨勢。刺激6h后表達量顯著升高；12h表達量下降，但在24h時顯著升高而且達到峰值，高表達一直持續(xù)到48h。所以HdCTL可能參與了皺紋盤鮑體內(nèi)的免疫防御過程，在抵御不同外源微生物入侵過程中發(fā)揮作用。
　　將HdCTL編碼區(qū)成熟肽克隆入Peasy-E1表達載體中，轉(zhuǎn)化導(dǎo)入Transetta表達系統(tǒng)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，利用鎳螯合瓊脂糖凝膠色譜法純化出rHdCTL重組蛋白，并利用梯

6、度稀釋法對重組蛋白進行復(fù)性，經(jīng)復(fù)性蛋白免疫小白鼠，收集抗血清獲得了抗rHdCTL多克隆抗體，利用western-bolt對抗體進行特異性分析，結(jié)果顯示抗rHdCTL多克隆抗體能特異性識別rHdCTL。
　　酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測了rHdCTL對mannan、zymosan、LPS、PGN和β-glucan五種 PAMPs的體外結(jié)合能力。rHdCTL可以體外結(jié)合 mannan和zymosan，對于zymosan的結(jié)合活性隨

7、著重組蛋白濃度的增加而增強，而對于LPS、PGN和β-glucan均無結(jié)合能力。這些結(jié)果說明HdCTL編碼蛋白可能介導(dǎo)皺紋盤鮑對于mannan和zymosan的免疫識別作用。
　　進一步研究了rHdCTL對于外源微生物的凝集活性。發(fā)現(xiàn)rHdCTL對假絲酵母菌和畢赤酵母菌具有凝集活性，推測對mannan和zymosan識別是其凝集真菌等微生物的分子基礎(chǔ)，表明HdCTL可作為模式識別受體參與皺紋盤鮑對于外源微生物的免疫識別和免疫應(yīng)答作

8、用。
　　檢測了 rHdCTL對皺紋盤鮑血細胞吞噬作用和包囊化的促進作用。rHdCTL能夠促進皺紋盤鮑血細胞對于外源微生物的吞噬作用。利用鎳瓊脂糖顆粒檢測rHdCTL對皺紋盤鮑血細胞包囊化的促進作用中發(fā)現(xiàn)，表面包被了rHdCTL的鎳瓊脂糖顆粒能夠促進皺紋盤鮑血細胞在體外對瓊脂糖顆粒的包囊化作用，這些結(jié)果表明rHdCTL可能參與皺紋盤鮑對于外源微生物清除過程。
　　綜上所述，本研究克隆得到了一個皺紋盤鮑C型凝集素HdCTL，并