皺紋盤鮑抗氧化基因的克隆及其在營養(yǎng)調(diào)控下表達的研究.pdf

1、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)隸屬于軟體動物門，腹足綱(Gastropoda)，前腮亞綱(Prosobranchia)，原始腹足目(Archaeogastropoda)，鮑科(Haliotidae)，主要分布在我國渤海和黃海，以及日本和朝鮮的附近海域，是世界重要的名貴海水養(yǎng)殖品種。但是近年來由于環(huán)境污染、操作不當、投飼頻率增加等原因，使得養(yǎng)殖的皺紋盤鮑不斷發(fā)生各類病害，其產(chǎn)量大幅度下跌，種質(zhì)出現(xiàn)衰退現(xiàn)象

2、。而環(huán)境中各種脅迫因子的增加和鮑魚免疫力的下降直接導致病原體的高感染率和鮑魚的高死亡率。但時至今日，皺紋盤鮑的先天性免疫學研究中仍然存在大量的空白，尤其是如何利用皺紋盤鮑的營養(yǎng)免疫機制來提高其免疫力的研究較少。所以深入開展皺紋盤鮑營養(yǎng)免疫機制研究并在此基礎上尋找增加皺紋盤鮑抗脅迫能力的有效方法已成為當務之急。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，在受到病原體、化學因子、輻射、溫度(高溫或者低溫)變化、溶解氧、營養(yǎng)不良以及其他可能的脅迫條件下，水生生

3、物體會產(chǎn)生大量的活性氧分子。這些活性氧分子能夠消滅掉外源入侵者，但同時由于活性氧分子反應的非特異性，它們也會對宿主的細胞、組織和器官造成嚴重傷害，進而導致皺紋盤鮑生理機能的損傷和免疫系統(tǒng)的破壞。所以，消除皺紋盤鮑體內(nèi)因過度免疫反應產(chǎn)生的過量氧自由基將能夠增強其抵御病原侵染的能力，提高免疫力。為了維持機體健康，避免活性氧對自身細胞造成損傷，阻止由于氧化脅迫引起的疾病和死亡，耗氧生物體在長期的氧脅迫環(huán)境以及外界生存環(huán)境中形成了一個行之有效的

4、抗氧化體系，以維持體內(nèi)產(chǎn)生適量ROS和清除多余ROS之間的平衡，進而維持動物機體內(nèi)氧化和抗氧化之間的動態(tài)平衡。其中，包括抗氧化酶系統(tǒng)，如：谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等，以及非酶類抗氧化分子，如硒結(jié)合蛋白、鐵蛋白、熱休克蛋白、維生素C和谷胱甘肽等。
　　 眾所周知，生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生、清除、利用、損傷及其修復所需物質(zhì)與能量均直接或間接來源于營養(yǎng)物質(zhì)及其代謝物，即動物體內(nèi)營養(yǎng)素及其

5、代謝物是各類自由基產(chǎn)生的物質(zhì)來源；清除自由基系統(tǒng)的成分均直接或間接來自營養(yǎng)素與膳食中抗氧化劑。因此，營養(yǎng)狀況應能維持自由基的產(chǎn)生與清除處于正常動態(tài)平衡，內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)定的還原態(tài)，并使各類活性氧的生理作用以及彼此相互作用能正常發(fā)揮。此外，大量研究已經(jīng)證明動物體能夠通過營養(yǎng)調(diào)控的方式獲得更好的氧化還原平衡，如通過獲得適量的硒、鋅、鐵和維生素C等。然而，尚未有關于營養(yǎng)素和皺紋盤鮑抗氧化系統(tǒng)在基因轉(zhuǎn)錄水平上進行相互作用研究的報道。此外，克隆和鑒定

6、抗氧化反應相關基因?qū)椭覀兏玫睦斫鈱τ跔I養(yǎng)調(diào)控的分子生物學機制。
　　 在本研究中，我們首先對皺紋盤鮑氧化還原平衡系統(tǒng)中的硒依賴型谷胱甘肽過氧化物酶(Se-GPX)，硒結(jié)合蛋白(SEBP)，熱休克蛋白90(HSP90)和鐵蛋白(FT)等進行了基因全長克隆，并對其分子結(jié)構(gòu)特征、組織分布特征及其在營養(yǎng)(硒、鐵和鋅)調(diào)控下的表達特征進行了相關分析。此外，我們還應用熒光定量PCR技術，對經(jīng)過維生素C調(diào)控下的皺紋盤鮑抗氧化相關基因(

7、Cu/Zn-SOD，Mn-SOD，CAT，GPX，GST，Tpx，SEBP，HSP26，HSP70和HSP90)和氧化脅迫相關基因(NF-KB)進行了相對定量的表達分析。
　　 1.皺紋盤鮑谷胱甘肽過氧化物酶的基因克隆及其在飼料中不同濃度硒、鋅和鐵元素處理下的表達分析
　　 以皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)(平均體長：65.01±0.45 mm)為材料，利用同源克隆技術和RACE技術從皺

8、紋盤鮑肝臟中成功擴增出中硒依賴型谷胱甘肽過氧化物酶(selenium-dependent glutathione peroxidase，HdhGPx)。HdhGPx全長為963bp(Genbank中的注冊號為GU254066)，包括21bp的5’非編碼區(qū)、273 bp的3’非編碼區(qū)和669 bp的開放閱讀框。另外，在3’非編碼區(qū)還存在一個101bp的SECIS作用原件。其中HdhGPx的開放閱讀框編碼222個氨基酸，預測分子量約為24.

9、76 KDa，理論等電點為7.00；在其N端含有一個23個氨基酸殘基編碼的信號肽。在HdhGPx的cDNA序列中含有一個典型的終止密碼子(235TGA237)用于編譯硒半胱氨酸(U72)，一個GPx信號基序2(96LGLPCNQF103)，一個GPx活化位點基序(179WNFEKF184)。此外，在HdhGPx的氨基酸序列中還存在兩個潛在的蛋白質(zhì)糖基化位點(112NGTE115和132NLTQ135)。在三維空間結(jié)構(gòu)上，HdhGPx顯示

10、出與人GPx3具有更高的結(jié)構(gòu)相似性。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，HdhGPx mRNA在肝臟、外套膜、鰓、性腺、肌肉和腎臟中的表達量要顯著高于在血細胞中的表達量，而且在肝臟中的表達量為最高。通過分別用不同濃度的微量元素硒(0.15 mg/kg，1.32 mg/kg和48.7 mg/kg)、鋅(6.69mg/kg，33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和鐵(29.19 mg/kg，65.7 mg/kg和1267.2 mg/

11、kg)的飼料來飼喂幼鮑(平均體長：13.05±0.25 mm)20周后，分別取其肝臟和血細胞總RNA，利用實時熒光定量PCR技術進行HdhGPx mRNA的表達分析。分析結(jié)果顯示，在硒處理組，皺紋盤鮑肝胰臟中HdhGPx mRNA的表達量隨硒添加量增加而升高。皺紋盤鮑肝胰臟中HdhGPx mRNA的表達量在硒添加量為1.32 mg/kg時表達量最高，但皺紋盤鮑血細胞中HdhGPx mRNA的表達量在硒過量組(48.7 mg/kg)為最高

12、。在鋅處理組，皺紋盤鮑肝胰臟中HdhGPx mRNA的表達量升高，但是在鋅添加量為33.85mg/kg達到最高。在鐵處理組，皺紋盤鮑HdhGPx mRNA的表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，即在鐵適量組(65.7 mg/kg)為最高，而后在鐵過量組(1267.2 mg/kg)肝胰臟中HdhGPx的表達量降低。上述研究結(jié)果表明HdhGPx的表達受到飼料中微量元素(硒、鋅和鐵)添加量的影響，而且可能在提高機體抗氧化能力和防止由微量元素含量過高引

13、起的氧化脅迫中擔負重要作用。
　　 2.皺紋盤鮑硒結(jié)合蛋白的基因克隆及其在飼料中不同濃度硒、鋅和鐵元素處理下的表達分析
　　 利用同源克隆技術和RACE技術從皺紋盤鮑肝臟中成功擴增出中硒結(jié)合蛋白(selenium-binding protein，HdhSEBP)。HdhSEBP全長為2071 bp(Genbank中的注冊號為GU014544)，包括55bp的5’非編碼區(qū)、522 bp的3’非編碼區(qū)和1494 bp的開放閱

14、讀框。其中HdhSEBP的開放閱讀框編碼497個氨基酸，預測分子量約為55.6 KDa，理論等電點為5.47。BLAST分析結(jié)果顯示HdhSEBP與其他物種，如哺乳動物、鳥、魚和無脊椎動物的SEBP氨基酸序列具有高度的相似性。此外，HdhSEBP的氨基酸序列中還存在多個金屬結(jié)合位點和一個潛在的蛋白質(zhì)糖基化位點(320NKTV323)。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，HdhSEBP mRNA在外套膜、腎臟、肝臟和血細胞中的表達量要顯著高于

15、在鰓、性腺和肌肉中的中的表達量，而且以在外套膜中的表達量為最高。通過分別用不同濃度的微量元素硒(0.15 mg/kg，1.32 mg/kg和48.7 mg/kg)、鋅(6.69 mg/kg，33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和鐵(29.19 mg/kg，65.7 mg/kg和1267.2mg/kg)的飼料來飼喂幼鮑(最初體長：13.05±0.25 mm)20周后，分別取其肝臟和血細胞總RNA，利用實時熒光定量PCR技術進

16、行HdhSEBP mRNA的表達分析。分析結(jié)果顯示，在硒處理組，皺紋盤鮑肝胰臟中HdhSEBP mRNA的表達量隨硒添加量增加而升高。皺紋盤鮑肝胰臟和血細胞中HdhSEBP mRNA在硒添加量為1.32 mg/kg時表達量均為最高水平。在鋅處理組，皺紋盤鮑肝胰臟和血細胞中HdhSEBP mRNA在鋅添加量為33.85 mg/kg時表達量均為最高，但是在鋅添加量為710.63 mg/kg降低到最低水平。在鐵處理組，皺紋盤鮑HdhSEBP

17、mRNA的表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，即在鐵適量組(65.7 mg/kg)為最高，而后在鐵過量組(1267.2 mg/kg)中HdhSEBP的表達量降低。上述研究結(jié)果表明HdhSEBP的表達受到飼料中微量元素(硒、鋅和鐵)添加量的影響，而且可能在提高機體抗氧化能力和防止由微量元素含量過高引起的氧化脅迫中擔負重要作用。
　　 3.皺紋盤鮑熱休克蛋白90的基因克隆及其在飼料中不同濃度硒、鐵和鋅元素處理下的表達分析
　　 以

18、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)(平均體長：65.01±0.45 mm)為材料，利用同源克隆技術和RACE技術從皺紋盤鮑肝臟中成功擴增出中熱休克蛋白90(heatshock protein90，HdhHSP90)。HdhHSP90全長為2660 bp(Genbank中的注冊號為GU014545)，包括96 bp的5’非編碼區(qū)、377 bp的3’非編碼區(qū)和2187 bp的開放閱讀框。其中HdhHSP90的開

19、放閱讀框編碼728個氨基酸，預測分子量約為84.134 KDa，理論等電點為4.619。BLAST分析結(jié)果顯示HdhHSP90與其他物種，如哺乳動物、鳥、魚和無脊椎動物的HSP90氨基酸序列具有高度的同源性。在HdhHSP90氨基酸序列中含有6個典型的熱休克蛋白家族的信號基序(NKEIFLRELISNSSDALDKIR，LGTIAKSGT，IGQFGVGFYSAYLVAE，IKLYVRRVFI，GVVDSEDLPLNISRE，MEEVD

20、)。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，HdhHSP90 mRNA在性腺和血細胞中的表達量較高。通過分別用不同濃度的微量元素硒(0.15 mg/kg，1.32 mg/kg和48.7mg/kg)、鋅(6.69 mg/kg，33.85 mg/kg和710.63 mg/kg)和鐵(29.19 mg/kg，65.7 mg/kg和1267.2 mg/kg)的飼料來飼喂幼鮑(最初體長：13.05±0.25 mm)20周后，分別取其肝臟和血細胞總RNA。

21、熒光定量PCR分析結(jié)果顯示，在硒處理組，皺紋盤鮑肝胰臟中HdhHSP90 mRNA的表達量隨硒添加量增加而升高。皺紋盤鮑肝胰臟和血細胞中HdhHSP90 mRNA在硒添加量為1.32 mg/kg時表達量均為最高水平。在鋅處理組，皺紋盤鮑肝胰臟和血細胞中HdhHSP90 mRNA在鋅添加量為33.85 mg/kg時表達量均為最高，但是在鋅添加量為710.63 mg/kg降低到最低水平。在鐵處理組，皺紋盤鮑HdhHSP90 mRNA的表達量

22、呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，即在鐵適量組(65.7 mg/kg)為最高，而后在鐵過量組(1267.2 mg/kg)中HdhHSP90的表達量降低。上述研究結(jié)果表明HdhHSP90的表達受到飼料中微量元素(硒、鋅和鐵)添加量的影響，而且可能在提高機體抗脅迫能力和保護動物機體免受由飼料中微量元素(硒、鋅和鐵)含量過高引起的氧化脅迫中擔負重要作用。
　　 4.皺紋盤鮑鐵蛋白的基因克隆及其在飼料中不同濃度鐵元素處理下的表達分析
　　

23、 利用文庫構(gòu)建技術和RACE技術從皺紋盤鮑肝臟中成功擴增出中一個新型的鐵蛋白(ferritin，HdhNFT)。HdhNFT全長為915bp(Genbank中的注冊號為GU479917)，包括103 bp的5’非編碼區(qū)、296 bp的3’非編碼區(qū)和516 bp的開放閱讀框。其中HdhNFT的開放閱讀框編碼171個氨基酸，預測分子量約為19.8.KDa，理論等電點為4.79。BLAST分析結(jié)果顯示HdhNFT與其他物種，如哺乳動物、鳥、魚

24、和無脊椎動物的FT氨基酸序列具有高度的相似性。此外，HdhNFT的氨基酸序列中還存在一個潛在的蛋白質(zhì)糖基化位點(27NCSY30)。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，HdhNFTmRNA在腎臟、肝臟、鰓、肌肉和外套膜和血細胞中的表達量要顯著高于在性腺和血細胞中的中的表達量，而且以在腎臟中的表達量為最高。通過用不同濃度的微量元素鐵(29.19 mg/kg，65.7 mg/kg，1267.2 mg/kg和6264.7 mg/kg)的飼料來飼喂

25、幼鮑(最初體長：13.05±0.25 mm)20周后，分別取其肝臟和血細胞總RNA，利用實時熒光定量PCR技術進行HdhSEBP mRNA的表達分析。分析結(jié)果顯示，皺紋盤鮑HdhNFT mRNA的表達量呈現(xiàn)升高的趨勢，即隨鐵添加量的增加，在鐵過量組(6264.7mg/kg)中HdhNFT的表達量最高。上述研究結(jié)果表明HdhNFT的表達受到飼料中鐵元素添加量的影響，而且可能在提高機體抗氧化能力和防止由鐵元素含量過高引起的氧化脅迫中擔負重要

26、作用。
　　 5.飼料中添加維生素C對皺紋盤鮑肝胰腺中抗氧化和脅迫相關基因表達的影響
　　 本研究以皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai Ino)(平均體長：84.36±0.24 mm)為研究對象，探討飼料中添加不同梯度維生素C對皺紋盤鮑肝胰腺組織中抗氧化脅迫相關基因(超氧化物歧化酶，SOD；過氧化氫酶，CAT；谷胱甘肽過氧化物酶，GPX；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，GST；硒結(jié)合蛋白，SEBP；熱休克蛋白2

27、6，HSP26；熱休克蛋白70，HSP70；熱休克蛋白90，HSP90)以及細胞核轉(zhuǎn)錄因子Rel/NF-KB等在轉(zhuǎn)錄水平上表達的影響。通過用添加了不同濃度維生素C(0.0 mg/kg，70.3 mg/kg，829.8 mg/kg和4967.5 mg/kg)的飼料來飼喂皺紋盤鮑成鮑，在室內(nèi)流水系統(tǒng)養(yǎng)殖24周后，取其肝臟總RNA，利用實時熒光定量PCR技術進行相關基因的表達水平的分析。分析結(jié)果顯示，與基礎飼料組相比，飼料中添加適量的維生素C

28、(70.3 mg/kg)能夠顯著提高皺紋盤鮑肝胰腺中抗氧化相關基因(Cu/Zn-SOD，CAT，GST，NFT，HSP26)mRNA的表達量，但是顯著降低Mn-SOD，GPX，TPX和SEBP mRNA的表達量。與添加適量的維生素C(70.3 mg/kg)飼料組相比，添加過量的維生素C(829.8 mg/kg和4967.5mg/kg)顯著提高皺紋盤鮑肝胰腺中Mn-SOD，GPX，TPx，SEBP，NFT，HSP70，HSP90和NF-K

29、B mRNA的表達量。上述研究結(jié)果表明飼料中維生素C能夠影響皺紋盤鮑抗氧化脅迫相關基因的表達量，這提示飼料中添加適量的維生素C能夠提高機體抗氧化能力，減輕機體內(nèi)的氧化脅迫程度。但是飼料中添加過量的維生素C會起到氧化劑的作用，從而降低皺紋盤鮑機體的抗脅迫能力。
　　 總體而之，飼料中添加適量的微量元素(硒、鋅和鐵)或抗氧化劑(維生素C)能夠顯著提高皺紋盤鮑抗氧化相關基因的表達量，進而提高機體的抗氧化脅迫的能力。而過量的微量元素(硒