皺紋盤鮑生殖腺功能成分及其構效關系的研究.pdf

1、近年來，我國鮑魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，產量逐年遞增，鮑魚加工業(yè)發(fā)展迅速。在加工過程中，產生了大量的低值副產物，如鮑魚臟器、鮑魚殼等，其中臟器約占鮑魚體重的20～30％，在加工過程中多數(shù)被直接丟棄，不僅造成了資源浪費，還帶來環(huán)境污染。鮑魚臟器中生殖腺所占比例很大，富含蛋白質、多糖等功能成分，對其進行有效利用十分必要。
　　本文以皺紋盤鮑生殖腺（Haliotis discus hannai Ino）為研究對象，通過生物酶法獲得生殖腺中的多

2、糖和多肽，對其進行構效關系方面的研究。主要研究內容及結果如下:
　　(1)采用堿性蛋白酶/胃蛋白酶復合水解技術及離子交換、凝膠排阻柱層析技術對皺紋盤鮑生殖腺多糖進行提取及分離純化，并對多糖組分進行化學組成對比分析。結果表明，皺紋盤鮑生殖腺粗多糖(Abalone GonadPolysaccharides，AGP)經分離純化得到三個均一的多糖組分，分別命名為AGP-31、AGP-32和AGP-33，分子量分別為37.8、32.2和27

3、.5 kDa。三個組分均為非糖胺聚糖類的硫酸化多糖，主要化學組成及含量為:蛋白質0.68～1.04％，中性糖53.10～58.82％，硫酸基8.30～9.48％,糖醛酸17.02～18.26％。其中，AGP-32的中性糖含量顯著高于另外兩個組分，糖醛酸含量顯著低于另外兩個組分，而AGP-33的硫酸基含量顯著高于另外兩個組分(p＜0.05)。三個多糖組分均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖8種單糖組成。<

4、br>　　(2)采用部分酸水解、甲基化、紅外光譜及核磁共振波譜分析確定皺紋盤鮑生殖腺多糖AGP-33的主鏈結構。結果表明，對AGP-33進行部分酸水解后得到皺紋盤鮑生殖腺多糖的主鏈部分BAGP-33，經高效液相色譜法檢測為均一多糖，分子量為17.0kDa。主鏈結構中只包含甘露糖、葡萄糖和半乳糖，比例為1∶1∶3，主要采取三種連接方式，即1→3連接，1→4連接和1→6連接。經綜合分析得出，皺紋盤鮑生殖腺多糖AGP-33的主鏈核心結構為[→

5、4)-α-Galp-(1→6)-α-Glcp-(1→]n。
　　(3)采用體外實驗研究皺紋盤鮑生殖腺多糖的促膽囊收縮素(CCK)釋放活性和抗凝血活性。以小鼠腸道內分泌腫瘤細胞STC-1為工具細胞，評價皺紋盤鮑生殖腺多糖促進CCK釋放活性，并對主要信號通路進行初步研究。結果表明，在濃度達到2mg/mL以上時，三種皺紋盤鮑生殖腺多糖均可顯著誘導STC-1細胞釋放CCK(p＜0.05)。Ca2+/鈣調蛋白/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca

6、2+/CaM/CaMKⅡ）、環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)-p38這3條信號通路都參與了AGP-32誘導的CCK釋放。通過體外抗凝血試驗對皺紋盤鮑生殖腺多糖的抗凝血活性進行評價。結果表明，三種多糖在濃度為25μg/mL以上時，均具有顯著的抗凝血活性(p＜0.01)，且均通過內源性凝血途徑和抑制血漿纖維蛋白原酶來發(fā)揮抗凝血作用。濃度為50μg/mL時，AGP-33及其主鏈部分（BAGP-33）、

7、脫硫產物(AGP-33-deS)中AGP-33的抗凝血活性最強，表明分子量、硫酸基含量及取代位點對多糖組分的抗凝血活性均有一定影響。
　　(4)以中性蛋白酶為工具酶，對皺紋盤鮑雄性生殖腺(Abalone MaleGonad，AMG)脫脂粉和雌性生殖腺(Abalone Female Gonad，AFG)脫脂粉進行酶解，考察水解效果。結果表明:雌、雄生殖腺凍干粉經丙酮脫脂后，蛋白含量分別達到50.46±0.53％和58.44±0.44

8、％。中性蛋白酶對雌、雄皺紋盤鮑生殖腺酶解效果均較好，且對雌性生殖腺的水解效果優(yōu)于雄性。酶解3h后，肽得率分別為51.20％和44.56％，水解度分別為37.12％和35.78％。雌性生殖腺酶解物(Abalone Female Gonad Hydrolysates，AMGHs)中分子量在3kDa以下的組分占酶解物的90％以上。氨基酸組分分析表明，雌、雄皺紋盤鮑生殖腺氨基酸種類齊全，必需氨基酸和呈味氨基酸約占總氨基酸的77％以上，是制備生物

9、活性肽的良好來源。
　　(5)針對水解過程中皺紋盤鮑雄性生殖腺酶解物(Abalone Male GonadHydrolysates，AMGHs)呈凝膠狀的現(xiàn)象，對其功能特性進行進一步研究。結果表明，水解過程中AMGHs的彈性模量(G')均大于黏性模量(G")，表明AMGHs是以彈性為主的體系。酶解物的凝膠性隨著酶解時間的延長而增強，呈現(xiàn)明顯的剪切稀化現(xiàn)象，為非牛頓流體中的假塑性流體。水解后，AMGHs的理化特性同AMG相比有所改善

10、。酶解50min后，溶解性顯著提高，在pH值2～10范圍內，氮溶指數(shù)達65％以上。持水性和持油性顯著提高(p＜0.05)。起泡性、泡沫穩(wěn)定性及表面疏水性隨著水解度增大先顯著增加，50min后變化不大。同時，AMGHs的乳化性隨水解度增大而降低。
　　(6)以中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風味蛋白酶和堿性蛋白酶水解皺紋盤鮑雌性生殖腺脫脂粉制備酶解物，并利用凝膠柱層析及ESI-QTOF-MS/MS質譜技術對皺紋盤鮑雌性生殖腺抗氧化肽進行分離