皺紋盤鮑生殖腺功能成分及其構(gòu)效關(guān)系的研究.pdf

1、近年來，我國(guó)鮑魚養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，產(chǎn)量逐年遞增，鮑魚加工業(yè)發(fā)展迅速。在加工過程中，產(chǎn)生了大量的低值副產(chǎn)物，如鮑魚臟器、鮑魚殼等，其中臟器約占鮑魚體重的20～30％，在加工過程中多數(shù)被直接丟棄，不僅造成了資源浪費(fèi)，還帶來環(huán)境污染。鮑魚臟器中生殖腺所占比例很大，富含蛋白質(zhì)、多糖等功能成分，對(duì)其進(jìn)行有效利用十分必要。
　　本文以皺紋盤鮑生殖腺（Haliotis discus hannai Ino）為研究對(duì)象，通過生物酶法獲得生殖腺中的多

2、糖和多肽，對(duì)其進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系方面的研究。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)采用堿性蛋白酶/胃蛋白酶復(fù)合水解技術(shù)及離子交換、凝膠排阻柱層析技術(shù)對(duì)皺紋盤鮑生殖腺多糖進(jìn)行提取及分離純化，并對(duì)多糖組分進(jìn)行化學(xué)組成對(duì)比分析。結(jié)果表明，皺紋盤鮑生殖腺粗多糖(Abalone GonadPolysaccharides，AGP)經(jīng)分離純化得到三個(gè)均一的多糖組分，分別命名為AGP-31、AGP-32和AGP-33，分子量分別為37.8、32.2和27

3、.5 kDa。三個(gè)組分均為非糖胺聚糖類的硫酸化多糖，主要化學(xué)組成及含量為:蛋白質(zhì)0.68～1.04％，中性糖53.10～58.82％，硫酸基8.30～9.48％,糖醛酸17.02～18.26％。其中，AGP-32的中性糖含量顯著高于另外兩個(gè)組分，糖醛酸含量顯著低于另外兩個(gè)組分，而AGP-33的硫酸基含量顯著高于另外兩個(gè)組分(p＜0.05)。三個(gè)多糖組分均由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖8種單糖組成。<

4、br>　　(2)采用部分酸水解、甲基化、紅外光譜及核磁共振波譜分析確定皺紋盤鮑生殖腺多糖AGP-33的主鏈結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，對(duì)AGP-33進(jìn)行部分酸水解后得到皺紋盤鮑生殖腺多糖的主鏈部分BAGP-33，經(jīng)高效液相色譜法檢測(cè)為均一多糖，分子量為17.0kDa。主鏈結(jié)構(gòu)中只包含甘露糖、葡萄糖和半乳糖，比例為1∶1∶3，主要采取三種連接方式，即1→3連接，1→4連接和1→6連接。經(jīng)綜合分析得出，皺紋盤鮑生殖腺多糖AGP-33的主鏈核心結(jié)構(gòu)為[→

5、4)-α-Galp-(1→6)-α-Glcp-(1→]n。
　　(3)采用體外實(shí)驗(yàn)研究皺紋盤鮑生殖腺多糖的促膽囊收縮素(CCK)釋放活性和抗凝血活性。以小鼠腸道內(nèi)分泌腫瘤細(xì)胞STC-1為工具細(xì)胞，評(píng)價(jià)皺紋盤鮑生殖腺多糖促進(jìn)CCK釋放活性，并對(duì)主要信號(hào)通路進(jìn)行初步研究。結(jié)果表明，在濃度達(dá)到2mg/mL以上時(shí)，三種皺紋盤鮑生殖腺多糖均可顯著誘導(dǎo)STC-1細(xì)胞釋放CCK(p＜0.05)。Ca2+/鈣調(diào)蛋白/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca

6、2+/CaM/CaMKⅡ）、環(huán)磷酸腺苷/蛋白激酶A(cAMP/PKA)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)-p38這3條信號(hào)通路都參與了AGP-32誘導(dǎo)的CCK釋放。通過體外抗凝血試驗(yàn)對(duì)皺紋盤鮑生殖腺多糖的抗凝血活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，三種多糖在濃度為25μg/mL以上時(shí)，均具有顯著的抗凝血活性(p＜0.01)，且均通過內(nèi)源性凝血途徑和抑制血漿纖維蛋白原酶來發(fā)揮抗凝血作用。濃度為50μg/mL時(shí)，AGP-33及其主鏈部分（BAGP-33）、

7、脫硫產(chǎn)物(AGP-33-deS)中AGP-33的抗凝血活性最強(qiáng)，表明分子量、硫酸基含量及取代位點(diǎn)對(duì)多糖組分的抗凝血活性均有一定影響。
　　(4)以中性蛋白酶為工具酶，對(duì)皺紋盤鮑雄性生殖腺(Abalone MaleGonad，AMG)脫脂粉和雌性生殖腺(Abalone Female Gonad，AFG)脫脂粉進(jìn)行酶解，考察水解效果。結(jié)果表明:雌、雄生殖腺凍干粉經(jīng)丙酮脫脂后，蛋白含量分別達(dá)到50.46±0.53％和58.44±0.44

8、％。中性蛋白酶對(duì)雌、雄皺紋盤鮑生殖腺酶解效果均較好，且對(duì)雌性生殖腺的水解效果優(yōu)于雄性。酶解3h后，肽得率分別為51.20％和44.56％，水解度分別為37.12％和35.78％。雌性生殖腺酶解物(Abalone Female Gonad Hydrolysates，AMGHs)中分子量在3kDa以下的組分占酶解物的90％以上。氨基酸組分分析表明，雌、雄皺紋盤鮑生殖腺氨基酸種類齊全，必需氨基酸和呈味氨基酸約占總氨基酸的77％以上，是制備生物

9、活性肽的良好來源。
　　(5)針對(duì)水解過程中皺紋盤鮑雄性生殖腺酶解物(Abalone Male GonadHydrolysates，AMGHs)呈凝膠狀的現(xiàn)象，對(duì)其功能特性進(jìn)行進(jìn)一步研究。結(jié)果表明，水解過程中AMGHs的彈性模量(G')均大于黏性模量(G")，表明AMGHs是以彈性為主的體系。酶解物的凝膠性隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈現(xiàn)明顯的剪切稀化現(xiàn)象，為非牛頓流體中的假塑性流體。水解后，AMGHs的理化特性同AMG相比有所改善

10、。酶解50min后，溶解性顯著提高，在pH值2～10范圍內(nèi)，氮溶指數(shù)達(dá)65％以上。持水性和持油性顯著提高(p＜0.05)。起泡性、泡沫穩(wěn)定性及表面疏水性隨著水解度增大先顯著增加，50min后變化不大。同時(shí)，AMGHs的乳化性隨水解度增大而降低。
　　(6)以中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶水解皺紋盤鮑雌性生殖腺脫脂粉制備酶解物，并利用凝膠柱層析及ESI-QTOF-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)對(duì)皺紋盤鮑雌性生殖腺抗氧化肽進(jìn)行分離