茶多酚緩解雞胚生殖腺氧化損傷的研究.pdf

1、近年來(lái),隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展,大量的合成化合物不斷釋放到環(huán)境中,對(duì)環(huán)境、生物和人體健康造成了巨大危害。其中一些具有激素樣作用的物質(zhì)被稱(chēng)為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemical,EDC),可導(dǎo)致人和動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)功能異常(如性激素和甲狀腺激素分泌障礙)、生殖器官異常(如精子減少、睪丸癌、乳腺癌)、神經(jīng)系統(tǒng)異常(如智能低下、多動(dòng)癥)和免疫系統(tǒng)異常(過(guò)敏性疾病增加),嚴(yán)重威脅動(dòng)物和人類(lèi)的生殖健康。
　　

2、 由于誘導(dǎo)氧化損傷是EDC生殖毒性機(jī)制中一個(gè)最重要的途徑,那么具有抗氧化活性的物質(zhì),尤其是食源性的植物性化合物,就可能預(yù)防EDC的毒性。茶多酚是從茶葉中提取出來(lái)的天然生物抗氧化劑,具有多方面的生物活性,其中抗氧化活性是茶多酚最基本的生物活性。由于EDC能引起白由基的產(chǎn)生和氧化損傷,而茶多酚具有清除自由基、螯合金屬離子的抗氧化作用,為此,本研究通過(guò)體內(nèi)、體外試驗(yàn),研究茶多酚對(duì)活性氧和EDC引起的雞胚氧化損傷的緩解作用,為茶多酚用于防治活

3、性氧和氧化性EDC引起的氧化損傷提供理論依據(jù)。
　　 1.生殖細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立和應(yīng)用
　　 用膠原酶分散18胚齡雞胚的睪丸,建立生殖細(xì)胞-體細(xì)胞的無(wú)血清共培養(yǎng)模型,培養(yǎng)液中添加了10μg/mL胰島素、5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8 mol/L亞硒酸鈉(稱(chēng)ITS培養(yǎng)液)。在該培養(yǎng)模型中,生殖細(xì)胞呈圓形生長(zhǎng),而體細(xì)胞呈梭狀生長(zhǎng)。促有絲分裂物質(zhì)如胰島素和轉(zhuǎn)鐵蛋白能維持生殖細(xì)胞的存活。胎牛血清能促進(jìn)細(xì)胞的存活,但細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)

4、于旺盛以至難以觀察生殖細(xì)胞形態(tài)的變化。而無(wú)血清ITS培養(yǎng)體系可防止體細(xì)胞的過(guò)度增殖,體細(xì)胞呈單層生長(zhǎng)便于顯微鏡下觀察生殖細(xì)胞的形態(tài)變化。用免疫細(xì)胞化學(xué)法進(jìn)一步證實(shí)了生殖細(xì)胞呈c-kit(干細(xì)胞因子的受體)染色陽(yáng)性,而體細(xì)胞呈陰性。自由基產(chǎn)生體系黃嘌呤-次黃嘌呤氧化酶(HX-XO)和農(nóng)業(yè)來(lái)源的除草劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D,50μg/mL)對(duì)生殖細(xì)胞呈現(xiàn)毒性作用。從形態(tài)

5、和功能兩方面證明本實(shí)驗(yàn)所建立的雞胚睪丸生殖細(xì)胞-體細(xì)胞無(wú)血清共培養(yǎng)模型可作為體外評(píng)價(jià)內(nèi)源性激素和外源性物質(zhì)如EDC生物活性的一種簡(jiǎn)易、快速、準(zhǔn)確并且易于觀察的離體模型,還可用于生殖毒理和繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控機(jī)理的研究。
　　 2.茶多酚對(duì)黃嘌呤-次黃嘌呤氧化酶引起的生殖細(xì)胞氧化損傷的緩解作用
　　 自由基是機(jī)體許多生化反應(yīng)的中間代謝物,在正常情況下處于產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡中。然而,過(guò)量的自由基就會(huì)損傷細(xì)胞,引起機(jī)體功能的障礙。在

6、動(dòng)物生產(chǎn)中,氧化應(yīng)激通過(guò)自由基危害動(dòng)物的健康,導(dǎo)致生產(chǎn)效率的下降。特別是動(dòng)物的生殖細(xì)胞,對(duì)氧化損傷較為敏感,因此自由基的及時(shí)清除,如采用抗氧化劑,則有利于動(dòng)物繁殖機(jī)能的正常發(fā)揮。本研究利用精原細(xì)胞-體細(xì)胞共培養(yǎng)模型研究茶多酚對(duì)雞胚精原細(xì)胞氧化損傷的緩解作用,由次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的活性氧自由基可引起脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的水平升高、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性降低,而茶多酚可將MD

7、A水平、SOD和GSH-Px活性恢復(fù)到對(duì)照組水平,說(shuō)明茶多酚通過(guò)抗氧化作用對(duì)活性氧引起的雞胚精原細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用。
　　 3.茶多酚對(duì)2,4-D引起的生殖細(xì)胞氧化損傷的緩解作用(離體研究)
　　 2,4-D是一種廣泛使用的控制雜草生長(zhǎng)的除草劑,是內(nèi)分泌干擾物的一種。2,4-D被廣泛應(yīng)用到農(nóng)業(yè),并對(duì)接觸的人和動(dòng)物造成了潛在的危害。2,4-D可以通過(guò)職業(yè)接觸,或從空氣中、飲水中和土壤中的殘留物危害人和動(dòng)物的健康。2

8、,4-D對(duì)家畜和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有胚胎毒、致畸毒和干擾生殖功能的作用。本試驗(yàn)利用精原細(xì)胞-體細(xì)胞體外無(wú)血清共培養(yǎng)模型研究茶多酚對(duì)精原細(xì)胞氧化損傷的緩解作用,結(jié)果表明:2,4-D可引起脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的水平升高、SOD和GSH-Px的活性降低,而茶多酚可將MDA水平、SOD和GSH-Px活性恢復(fù)到對(duì)照組水平,說(shuō)明茶多酚通過(guò)抗氧化作用對(duì)2,4-D引起的雞胚精原細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用,其保護(hù)作用的機(jī)理可能是抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,清除自由基。

9、>　　 4.茶多酚對(duì)活性氧及2,4-D引起的雞胚性腺氧化損傷的保護(hù)作用(在體研究)
　　 本實(shí)驗(yàn)研究了茶多酚、HX-XO、2,4-D單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)雞胚性分化開(kāi)始后性腺發(fā)育的影響。在孵化的第10天往氣室內(nèi)注入茶多酚(50μg/枚)、HX-XO(HX,0.5μmol,HX,0.25U/枚)、茶多酚+HX-XO、2,4-D(25μg/枚)和茶多酚+2,4-D,注射體積為50μl。在第19天取出睪丸、卵巢和肝臟,稱(chēng)重,然后進(jìn)行形態(tài)學(xué)

10、研究。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比HX-XO、2,4-D均使睪丸、卵巢質(zhì)量下降,肝臟質(zhì)量沒(méi)有明顯變化,而添加茶多酚后睪丸、卵巢質(zhì)量恢復(fù)到對(duì)照組水平。HX-XO、2,4-D對(duì)雌性和雄性生殖細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的毒性作用,作用于睪丸會(huì)導(dǎo)致睪丸萎縮,曲細(xì)精管直徑比對(duì)照組顯著減少(P＜0.01),雄性的精細(xì)管結(jié)構(gòu)也受到破壞,使生精細(xì)胞分化受到抑制,使大多數(shù)生殖細(xì)胞發(fā)生核固縮和胞質(zhì)空泡化,細(xì)胞間隙增大。添加茶多酚后曲細(xì)精管直徑有了明顯的增加,生殖細(xì)胞也基本恢