利用轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)沉默稻縱卷葉螟海藻糖酶基因.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球近半數(shù)人以稻米為食，一直以來，蟲害是造成水稻減產(chǎn)的主要原因之一。稻縱卷葉螟(Cnaphalocrocis medinalis)，俗稱卷葉蟲，屬于鱗翅目(Lepidoptera)螟蛾科(Pyralidae)，是對(duì)水稻危害最為嚴(yán)重的主要害蟲之一。海藻糖酶是昆蟲體內(nèi)海藻糖代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶，在昆蟲發(fā)育和能量調(diào)節(jié)中具有重要作用，是害蟲控制的理想靶標(biāo)。RNA干擾(RNA interference,RNAi)是指

2、在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。本研究的主要目的是利用轉(zhuǎn)基因RNAi技術(shù)，獲得對(duì)稻縱卷葉螟海藻糖酶基因具有沉默作用的轉(zhuǎn)基因水稻植株，為稻縱卷葉螟的生物防治奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.稻縱卷葉螟可溶型海藻糖酶基因的克隆及表達(dá)譜
　　采用RACE-PCR方法從稻縱卷葉螟中克隆得到可溶型海藻糖酶基因（CmTre1）的全長cDNA，其長度為2364 bp，開放閱讀框長1704

3、bp，編碼567個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析顯示該酶前端有16個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，但無跨膜結(jié)構(gòu)域，等電點(diǎn)為5.32。同源建模預(yù)測顯示，CmTre1的三維分子結(jié)構(gòu)中含18個(gè)α螺旋，2個(gè)β折疊片。同源性分析表明CmTre1與竹蠹螟(Omphisa fuscidentalis)的可溶型海藻糖酶相似性最高，為74％；與紅帶袖蝶和帝王蝶的可溶型海藻糖酶的相似性分別為67%和66%?；虮磉_(dá)譜分析表明，CmTre1在稻縱卷葉螟不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，蛹中的

4、表達(dá)量最低，成蟲中表達(dá)量最高；CmTre1在檢測的成蟲組織中都有表達(dá)，其表達(dá)水平從高到低為：中腸>表皮>馬氏管>頭>卵巢>脂肪體>肌肉>精巢。
　　2.重組RNA干擾表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　以稻縱卷葉螟可溶型海藻糖酶基因（CmTre1）為靶標(biāo)，設(shè)計(jì)RNAi靶位點(diǎn)并將其命名為CmTre1*，分別在兩端添加BamH I和Spe I酶切位點(diǎn)并進(jìn)行人工合成，經(jīng)雙酶切后與植物表達(dá)載體p1301連接，構(gòu)建p1301-CmTre1*重組

5、表達(dá)載體。PCR、雙酶切及測序鑒定結(jié)果表明重組表達(dá)載體p1301-CmTre1*構(gòu)建成功，并將其成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404，構(gòu)建基因工程菌。
　　3.轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及RNA干擾效應(yīng)檢測
　　用含有p1301-CmTre1*質(zhì)粒的農(nóng)桿菌LBA4404浸染中花11號(hào)水稻的愈傷組織，經(jīng)過愈傷組織的抗性篩選、分化和植株再生，獲得74株轉(zhuǎn)基因再生植株。GUS染色及靶標(biāo)位點(diǎn)的PCR和RT-PCR檢測結(jié)果表明，26株是含有CmTre1