Myostatin基因沉默轉(zhuǎn)基因羊的培育探索.pdf

1、Myostatin(肌肉生長抑制素)基因是肌肉生長發(fā)育的負調(diào)控因子，該基因的突變或缺失的牛肌肉發(fā)達，實驗室獲得的該基因沉默的轉(zhuǎn)基因鼠和斑馬魚肌肉發(fā)達程度均顯著增強。Myostatin基因在肌肉發(fā)育中的作用已被廣泛認可，因此Myostatin基因在動物新品種的培育方面具有巨大潛力。羊是重要的經(jīng)濟動物，提高羊的生長速度及瘦肉率具有重要經(jīng)濟價值。本研究欲培育出Myostatin基因沉默的轉(zhuǎn)基因羊，同時聯(lián)合利用慢病毒技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、流式細

2、胞分選等技術(shù)建立一種快速建立轉(zhuǎn)基因陽性細胞系的方法，為建立轉(zhuǎn)基因動物模型提供參考。本研究主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 1．RNA干擾片段的篩選。根據(jù)RNA干擾片段設(shè)計原理設(shè)計4條干擾片段并連接到pSilencer4.1-CMVneo載體上。利用脂質(zhì)體將干擾載體轉(zhuǎn)染進成纖維細胞內(nèi)，48h后提取RNA。利用半定量PCR檢測Myostatin基因的相對表達量，篩選出一條沉默率90％的RNA干擾片段。
　　 2．慢病毒包裝。將

3、獲得的高效RNA干擾片段連接至慢病毒穿梭質(zhì)粒，構(gòu)建GSS1穿梭質(zhì)粒，將慢病毒穿梭質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，48、72h收集細胞上清液，經(jīng)離心獲得病毒顆粒，利用稀釋法檢測慢病毒滴度，滴度約1×108tu/mL。
　　 3．Myostatin基因沉默成纖維細胞系的建立。將獲得的高滴度慢病毒感染成纖維細胞，72h熒光顯微鏡下觀察感染效率，在傳第3代時進行流式細胞術(shù)分選，轉(zhuǎn)基因陽性細胞率為94.5％，為提高陽性率，在第