蠟蚧輪枝菌[Lecanicillium lecanii(Zimmerman)Viegas]苯菌靈抗性基因轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、蠟蚧輪枝菌(Lecanicillium lecanii)是一種重要的蟲生真菌,寄主范圍廣,對蚜蟲、粉虱、蚧、薊馬、害螨等農(nóng)業(yè)害蟲均具有良好的寄生效果,是一種優(yōu)良的生防真菌。但蠟蚧輪枝菌對常用的殺菌劑敏感,在病蟲害綜合防治中與殺菌劑不易兼容使用,影響真菌殺蟲劑的效果發(fā)揮。本研究針對這一問題,篩選苯菌靈抗性菌株,克隆苯菌靈抗性基因,將其導(dǎo)入蠟蚧輪枝菌,使蠟蚧輪枝菌具有較高的抗藥性,協(xié)調(diào)生物防治與化學(xué)防治。本研究主要結(jié)果如下:
　　

2、1.篩選得到抗藥性強(qiáng)的菌株:從長期使用苯并咪唑類殺菌劑的農(nóng)田中采集植物病原菌,從北京農(nóng)產(chǎn)品市場采集貯藏期植物病原菌,同時收集一些其他研究單位收藏的菌株,分離純化鑒定為3屬5種(35個菌株),利用菌落直徑法對各菌株的苯菌靈敏感性進(jìn)行了測定,篩選出一批敏感菌株,EC50為0.0158-0.0384μg／mL,篩選出2個高抗性的菌株,EC50最高達(dá)到936.2670μg／mL。
　　 2.克隆得到具有高抗苯菌靈的基因:以篩選出的灰葡萄

3、孢霉SD2菌株為出發(fā)材料,以灰葡萄孢霉BenA基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物,以cDNA為模板同源克隆到苯菌靈抗性基因BenA,克隆得到的基因與Genebank登錄的BenA基因的同源性為99％,其編碼的第198位氨基酸為纈氨酸(Val),證明克隆得到的基因具有抗苯菌靈的特性。
　　 3.構(gòu)建BenA基因表達(dá)載體:以pBHt2質(zhì)粒為基礎(chǔ),擴(kuò)增真菌啟動子TrpC,通過套疊PCR方式將TrpC、BenA連接,用T4 DNA連接酶將“TrpC

4、-BenA”片段與載體PGM-T線性片段連接,形成pGM-TB載體；用T4 DNA連接酶將雙酶切(SacⅠ和HindⅢ)載體pGM-TB所產(chǎn)生的小片段與雙酶切載體pBHt2所產(chǎn)生的大片段連接起來,形成pBHt2-TB載體,將pBHt2-TB載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL-1中。
　　 4.建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的蠟蚧輪枝菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng):采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,通過表達(dá)載體pBHt2-TB將苯菌靈抗性基因?qū)氲较烌惠喼鶦A14菌株中,以潮霉素B為標(biāo)記篩選

5、轉(zhuǎn)化子。對轉(zhuǎn)化系統(tǒng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化,優(yōu)化結(jié)果:誘導(dǎo)培養(yǎng)基AS的濃度為200μM,誘導(dǎo)培養(yǎng)時間為4-6h,農(nóng)桿菌終濃度OD600值為0.6,共培養(yǎng)基AS的濃度為200μM,共培養(yǎng)時間為36-48h,共培養(yǎng)溫度在24-28℃,蠟蚧輪枝菌孢子濃度為106個孢子／mL。系統(tǒng)轉(zhuǎn)化效率為24個轉(zhuǎn)化子／106個孢子。
　　 5.得到具有較高抗性的轉(zhuǎn)化子:從大量的轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑選47株假定轉(zhuǎn)化子進(jìn)行檢測,根據(jù)啟動子和抗性基因連接處的序列設(shè)計引物,