外源表皮降解蛋白酶基因(Cdep1)轉(zhuǎn)化蠟蚧菌及其酶活性增強效果評價.pdf

1、蠟蚧菌是一種重要的蟲生真菌，對于溫室害蟲具有良好的防治效果，但是由于其作用過程慢、效果容易受環(huán)境的影響，所以在實際應(yīng)用中受到很大的限制。在蠟蚧菌侵染害蟲的過程中，其分泌的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶等胞外酶具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，增加生防真菌胞外酶的分泌，能顯著地提高真菌的毒力水平。本研究從白僵菌中克隆得到一個蛋白酶基因，將其導(dǎo)入蠟蚧菌中，提高蠟蚧菌的蛋白酶分泌水平，以此改良蠟蚧菌菌株。主要研究結(jié)果如下:
　　1.克隆外源蛋白酶基因。從一株性

2、狀優(yōu)良的球孢白僵菌中克隆蛋白酶基因 Cdep1，根據(jù)GenBank中已有的白僵菌蛋白酶基因設(shè)計引物，同源克隆得到了白僵菌的蛋白酶基因Cdep1。經(jīng)Blast比對，其與白僵菌蛋白酶基因（HQ840791）的序列同源性為99％。其對應(yīng)的氨基酸序列與堿性絲氨酸蛋白酶（KGQ12177）的同源性為99%，其中第128位的氨基酸由絲氨酸突變?yōu)槔野彼幔?39位氨基酸由纈氨酸突變?yōu)楸彼帷?br>　　2.構(gòu)建了Cdep1蛋白酶的真菌表達載體。以質(zhì)粒p

3、AN7-1為模板，分別克隆得到啟動子GdpA、終止子TrpC。采用重疊PCR的方法，結(jié)合降落PCR，構(gòu)建片段GdpA-Cdep1-TrpC（4021bp）。質(zhì)粒pBht2和連接片段經(jīng)過KpnI和HindIII酶切后，使用T4連接酶將該片段與真菌表達質(zhì)粒pBht2連接，構(gòu)建了其表達的重組質(zhì)粒。
　　3.應(yīng)用了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化蠟蚧菌。使用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)，陽性農(nóng)桿菌在與蠟蚧菌分生孢子共培養(yǎng)2天后轉(zhuǎn)接到抗性平板中

4、，培養(yǎng)至可見單菌落進行驗證，結(jié)果獲得大量的轉(zhuǎn)化子，隨機挑選100個轉(zhuǎn)化子做進一步的鑒定。對蠟蚧菌的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的條件進行了優(yōu)化，結(jié)果表明蠟蚧菌孢子以1.5×108的濃度接種到土豆液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時，按照1:40的比例加入復(fù)配的30mg/mL的裂解液（溶菌酶:纖維素酶:蝸牛酶=2:1:1），酶解3小時，蠟蚧菌的原生質(zhì)體數(shù)量可以達到1.8×107個/g。
　　4.轉(zhuǎn)化子拷貝數(shù)鑒定。根據(jù)已報道的單拷貝基因 EF1α設(shè)計擴增內(nèi)參引

5、物，采用 Beacon Designer設(shè)計目的基因引物AM-3，使用熒光定量PCR技術(shù)，對28個轉(zhuǎn)化子進行拷貝數(shù)檢測。在消除擴增效率和擴增片段大小的差異后，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化子中單拷貝的有9株，兩拷貝和三拷貝的各有1株。保留單拷貝的菌株用于酶活性評價。
　　5.轉(zhuǎn)化子酶生物活力評價。使用紫外分光光度計，通過對蛋白酶水解酪素產(chǎn)生的酪氨酸含量的測定，檢測陽性菌株的蛋白酶活力，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子酶活性最高比出發(fā)菌株提高了10倍，具有進一步研究