渝貴地區(qū)西瓜蔓枯病菌對多菌靈和苯醚甲環(huán)唑抗性監(jiān)測及對多菌靈的抗性機(jī)理.pdf

1、由瓜類黑腐球殼菌（Didymella bryoniae）所引起的西瓜蔓枯病是一種世界性的西瓜病害之一，在我國各西瓜產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。施用多菌靈、苯醚甲環(huán)唑等化學(xué)殺菌劑是其重要的防治手段，但長期單一使用某種化學(xué)藥劑導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生，使得防治效果降低甚至防治失敗，而國內(nèi)在西瓜蔓枯病菌的抗藥性研究方面報(bào)道較少，因此本文在渝貴地區(qū)采樣并分離獲得蔓枯病菌的基礎(chǔ)上，開展了關(guān)于渝貴地區(qū)西瓜蔓枯病菌對多菌靈和苯醚甲環(huán)唑敏感性、兩種主要防治

2、藥劑的抗性動態(tài)、田間抗性菌株的主要生物學(xué)特性以及西瓜蔓枯病菌對多菌靈的抗性機(jī)理方面的研究。通過該研究為多菌靈在蔓枯病菌上的抗性治理提供理論參考，同時(shí)為苯醚甲環(huán)唑的用藥前景和策略提供理論依據(jù)。主要結(jié)果如下：
　　1.西瓜蔓枯病菌對多菌靈的敏感性基線以及田間抗性分布
　　本研究采用菌絲生長速率法測定了106株西瓜蔓枯病野生菌對多菌靈的的敏感性，結(jié)果表明多菌靈對西瓜蔓枯病菌的抑制中濃度 EC50值最大為0.9482μg/mL，最小

3、0.5104μg/mL，不同敏感性的菌株分布頻率呈連續(xù)的單峰曲線分布，平均 EC50值為0.7125±0.0842μg/mL，最低抑制濃度（Minimal inhibition concentrion,MIC）≦4.5μg/mL。據(jù)此，確定以0.7125±0.0842μg/mL為渝貴地區(qū)西瓜蔓枯病菌對多菌靈的敏感性基線；以含多菌靈10、50和100μg/mL分別作為田間低、中和高抗的區(qū)分劑量，對從重慶市的北碚區(qū)、武隆縣、合川區(qū)、永川區(qū)和

4、貴州省息烽縣、修文縣等6個(gè)區(qū)縣所采集分離得到的591株菌株進(jìn)行抗性監(jiān)測，結(jié)果表明田間以抗性菌株為主，多菌靈抗性頻率為69.2％，并且全部為高抗菌株。2014年，抗性頻率最高的是重慶武隆，占94.7%、最低的地區(qū)為合川，占38.5%、2015年，抗性頻率最高還是重慶武隆，為98.5%，最低地區(qū)是貴州修文，為2.4%，抗性發(fā)展最快的是合川，2014抗性頻率為36.5%、到2015上升為86.9%。隨機(jī)選取的19株抗性菌株測得的平均抗性倍數(shù)為

5、358，以上結(jié)果說明西瓜蔓枯病菌的多菌靈田間抗性普遍且嚴(yán)重，應(yīng)該停止使用多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑。
　　2.西瓜蔓枯病菌多菌靈抗性菌株的主要生物學(xué)特性
　　本研究將西瓜蔓枯病菌的多菌靈田間抗性菌株在無藥劑選擇壓力的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)8代，每隔一代測定一次抗性EC50值，通過比較不同代數(shù)之間的EC50值，結(jié)果表明田間抗性菌株的抗藥性能穩(wěn)定遺傳。
　　抗性菌株在生活力、繁殖力等方面是否與敏感菌株具有顯著差異，是判斷抗性

6、菌株環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)弱的標(biāo)準(zhǔn)，也是進(jìn)行抗性風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)之一。本研究比對了抗性菌株與敏感菌株在生活力、繁殖力、致病力以及不同溫度對抗、敏菌株生長的影響的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗性菌株在生活力、繁殖力和致病性方面與敏感菌株沒有顯著差異。在同一溫度下，抗性菌株與敏感菌株的生活力沒有顯著差異，隨著抗性的產(chǎn)生，菌株的溫度耐受性沒有發(fā)生改變，因此抗性菌株對環(huán)境的適應(yīng)性沒有下降。
　　本研究通過對多菌靈抗性菌株對不同類型的藥劑的敏感性測定，交互抗性測定結(jié)

7、果表明，西瓜蔓枯病菌對多菌靈的抗性、敏感菌株對乙霉威（Diethofencarb），戊唑醇(Tebuconazloe)、苯醚甲環(huán)唑（Difenoconazole）、醚菌酯（Kresoxim-methy）、咯菌腈（Fludioxonil）、啶酰菌胺（Boscalid）、甲基立枯磷（Tolclofos-methyl）都表現(xiàn)為敏感，而西瓜蔓枯病菌對多菌靈的抗性菌株對苯并咪唑類的甲基硫菌靈表現(xiàn)為抗性，平均抗性倍數(shù)為14.62倍，說明在所測的8種

8、藥劑中，只有多菌靈與甲基硫菌靈具有交互抗性，而與其他7種藥劑之間沒有交互抗性，可以在田間輪換使用。
　　4.西瓜蔓枯病菌對多菌靈的抗性機(jī)理
　　為了清楚西瓜蔓枯病菌多菌靈田間抗性菌株是否因?yàn)棣?微管蛋白基因突變而導(dǎo)致抗性的產(chǎn)生。本研利用引物 GK-F1（5’-TGGTGCTGGTAACAACTG-3’）和GK-R1（5’-GTCCTCGACCTCCTTCAT-3’）對20個(gè)抗性菌株、12個(gè)敏感菌株β-微管蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，測

9、序后分別獲得了抗性、敏感菌株的部分β-微管蛋白基因的堿基序列，通過抗性與敏感的比對后發(fā)現(xiàn)主要涉及8個(gè)堿基的突變，其他7個(gè)位點(diǎn)的突變沒有引起氨基酸的突變，只有593位堿基由A變?yōu)镃，相應(yīng)的多菌靈抗性菌株的198位氨基酸由谷氨酸（Glu）變?yōu)榱吮彼幔ˋla），這是西瓜蔓枯病菌對多菌靈產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制。
　　5.西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環(huán)唑的敏感性基線以及田間抗性分布
　　為了掌握渝貴地區(qū)西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環(huán)唑的的抗性動態(tài)，本研

10、究對所采集分離的全部菌株進(jìn)行了抗性監(jiān)測，而敏感性基線的建立是進(jìn)行抗藥性監(jiān)測的基礎(chǔ)，據(jù)此本研究采用菌絲生長速率法測定了101株西瓜蔓枯病菌野生菌株對苯醚甲環(huán)唑的的敏感性，結(jié)果表明苯醚甲環(huán)唑?qū)ξ鞴下莶【囊种浦袧舛?EC50值在0.01348-0.17061μg/mL之間，最大值是最小值的12.7倍。不同敏感性菌株的頻率呈連續(xù)單峰曲線近正態(tài)分布，平均EC50值為0.05691±0.002890μg/mL，以此作為西瓜蔓枯病菌對苯醚甲環(huán)唑的

11、敏感性基線；同時(shí)以15、50和100μg/mL濃度的藥劑為區(qū)分劑量對重慶和貴州的西瓜蔓枯病菌進(jìn)行田間抗性監(jiān)測，結(jié)果表明田間以敏感菌株為主，檢測到少量的低抗菌株和中抗菌株，頻率分別為0.67%與2.03%，未檢測到高抗菌株。
　　6.苯醚甲環(huán)唑抗性菌株的主要生物學(xué)特性
　　藥劑抗性風(fēng)險(xiǎn)的評估的標(biāo)準(zhǔn)之一是對抗性菌株的生活力、繁殖力等方面與敏感菌株進(jìn)行對比，判斷其差異性。本研究在比對了抗性菌株與敏感菌株在生活力、繁殖力、致病力、不

12、同溫度對抗、敏菌株生長的影響，結(jié)果表明抗性菌株在生活力、繁殖力等方面與敏感菌株具有顯著差異，抗性菌株的生活力、繁殖力顯著弱于敏感菌株。在同一溫度下，抗性菌株的生活力要顯著弱于敏感菌株，隨著抗性的產(chǎn)生，菌株的溫度耐受性發(fā)生改變，說明抗性菌株對環(huán)境的適應(yīng)性下降，發(fā)展為抗性群體的風(fēng)險(xiǎn)有所下降。
　　為了研究西瓜蔓枯病菌苯醚甲環(huán)唑的田間抗性菌株的抗藥性是否能在無選擇壓力的條件下穩(wěn)定遺傳，在無藥劑選擇壓力的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)8代，每隔一

13、代測定一次抗性 EC50值，結(jié)果表明田間抗性菌株的抗藥性能穩(wěn)定遺傳。在日常使用化學(xué)藥劑中，同類型的藥劑應(yīng)避免重復(fù)使用，本研究對苯醚甲環(huán)唑抗性菌株進(jìn)行不同藥劑敏感性的測定，交互抗性測定結(jié)果表明，西瓜蔓枯病菌的苯醚甲環(huán)唑的抗性菌株對乙霉威、戊唑醇，醚菌酯均表現(xiàn)為抗性，平均抗性倍數(shù)分別為15.54、79.4和63.7倍；而抗性菌株與敏感菌株都對咯菌腈、啶酰菌胺、甲基立枯磷表現(xiàn)敏感，說明苯醚甲環(huán)唑與乙霉威、戊唑醇、醚菌酯之間具有交互抗性，而與咯

14、菌腈、啶酰菌胺、甲基立枯磷沒有交互抗性，可以在田間交替使用。
　　本研究表明渝貴地區(qū)西瓜蔓枯病菌對多菌靈抗性普遍且嚴(yán)重，以多菌靈為代表的苯并咪唑類藥劑已經(jīng)不能有效控制該病害的發(fā)生，需要新的藥劑替換；而對苯醚甲環(huán)唑則是敏感菌株為主，也出現(xiàn)少量敏感性下降的亞群體，表現(xiàn)為低抗和中抗，對該類藥劑不應(yīng)該長期使用，最好是與不同作用類型的藥劑輪換使用，以延長苯醚甲環(huán)唑的使用年限。同時(shí)對西瓜蔓枯病菌的β-微管蛋白基因的研究表明，β-微管蛋白基因堿