定植于桉樹根產(chǎn)酸克雷伯氏菌突變體的篩選及其功能基因.pdf

1、桉樹（Eucalyptus robusta）是我國重要的經(jīng)濟樹種，但其生長過程耗肥大，目前實際生產(chǎn)中大量施用化肥以滿足其生長的營養(yǎng)需求，因此帶來一系列負面影響。自生固氮菌能與多種植物形成聯(lián)合固氮體系，具有一定利用的價值。
　　本文從桉樹林分離篩選出一株自生固氮菌，命名為KO108。采用PCR技術(shù)克隆16SrRNA基因可變區(qū)序列，在NCBI上的登陸號為KM460926.1。同時利用常規(guī)鑒定方法并結(jié)合Biolog微生物鑒定系統(tǒng)，鑒定該

2、菌株為革蘭氏陰性產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca），屬于腸桿菌科(Enterbateriaceae)克雷伯氏菌屬（Klebsiella）。
　　利用藥敏試紙對菌株KO108進行抗生素抗性檢測，結(jié)果表明該菌株對呋喃妥因、鏈霉菌、頭孢曲松、卡那霉素、氧氟沙星、強力霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素敏感;對復(fù)方新諾明中度敏感;對多粘菌素、青霉素G、四環(huán)素、紅霉素不敏感，青霉素G對其的抑菌圈直徑為0。
　　以轉(zhuǎn)座子[mTn5

3、gusA-pgfp21]對產(chǎn)酸克雷伯氏菌KO108進行突變，篩選能定植于桉樹根系表面的突變體，嘗試建立一種木本植物與固氮細菌的互利促生體系。
　　菌株KO108和Escherichia coliS17.1兩親結(jié)合，經(jīng)轉(zhuǎn)座子[mTn5gusA-pgfp21]結(jié)合轉(zhuǎn)移并隨機插入突變建立KO108的Kan抗性標記，GUS活性，GFP遺傳標記的突變體庫。隨機選擇突變體，以750bp GFP綠色熒光蛋白序列為探針Southern雜交，結(jié)果顯

4、示轉(zhuǎn)座子[mTn5gusA-pgfp21]為單插入，片段大小不同，驗證結(jié)果顯示該突變體庫隨機性良好。
　　以桉樹根與突變體庫共同培養(yǎng)篩選可以定植于桉樹根的突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2株較穩(wěn)定地附著于桉樹根系表面，編號為MA和MD，但野生菌株KO108不能定植于桉樹根。
　　以轉(zhuǎn)座子[mTn5gusA-pgfp21]的GUS1和IS50R端各1條引物對Sau3AⅠ的酶切MA和MD基因組的自連產(chǎn)物進行反向PCR，分別得到一段671bp和

5、195bp的片段，通過NCBI數(shù)據(jù)庫Blast比對結(jié)果顯示MA的[mTn5gusA-pgfp21]插入位點所在片段與產(chǎn)酸克雷伯氏菌NAD(P)H醌類氧化還原酶基因核苷酸水平有87％一致性，而MD與產(chǎn)酸克雷伯氏菌LPS脂多糖生物合成基因簇核苷酸水平有99％一致性。
　　采用Epicentre pWEBTM Cosmid Cloning Kit構(gòu)建KO108基因組文庫，克隆數(shù)目為1329個。通過EcoRⅠ酶切分析隨機挑取的20個文庫克

6、隆的重組質(zhì)粒，結(jié)果顯示所有質(zhì)粒均有8.179 bp載體條帶同時含有外源DNA，且外源DNA的帶型并不相同，這表明所構(gòu)建的KO108基因組文庫中插入的外源DNA隨機性較好。分析EcoRⅠ酶切隨機挑取的20個文庫克隆的重組質(zhì)粒的外源DNA電泳條帶的大小，結(jié)果顯示克隆的外源DNA片段最小約為25 kb，最大約為50kb，平均大小估算為40 kb，文庫克隆容量約52 Mb，證明該基因組文庫包含基因組任意一個基因的概率為99.8％，是KO108基