SEDT-PA致病基因WISP3突變體在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究.pdf

1、第一部分晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病(SEDT-PlA)致病基因WISP3突變體的構(gòu)建 目的：Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白3(WISP3)是晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病(SED-PA)的致病基因，構(gòu)建WISP3基因致病型(1000T-C，840delT)的突變體，為研究突變基因的表達(dá)、定位和功能及SEDT-PA的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 方法：用RT-PCR方法從正常人軟骨細(xì)胞獲得野生型WISP3基因的全長cDNA(

2、WT-WISP3)，用定點(diǎn)突變方法獲得已報(bào)道的兩種WISP3基因突變類型的全長cDNA(MUT<'1000T/C>和MUT<'840delT>)；經(jīng)T載體克隆，測序證實(shí)后，將它們再分別亞克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和帶綠色熒光蛋白靶標(biāo)的真核表達(dá)載體pEGFP-C2中，酶切和測序?qū)Σ迦肫芜M(jìn)行分析和鑒定。 結(jié)果：構(gòu)建的野生型WISP3基因和突變體的全長eDNA序列分別與文獻(xiàn)及SEDT-PA患者WISP3基因突變類型一致

3、；測序和酶切鑒定證實(shí)所有的插入片段序列正確。 結(jié)論：運(yùn)用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了SEDT-PA致病基因WISP3突變體，為進(jìn)一步探討SEDT-PA的發(fā)病機(jī)制創(chuàng)造條件。 第二部分WISP3基因突變體在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)、定位及其功能的研究 第一章WISP3基因突變體在軟骨細(xì)胞中的表達(dá)和定位 目的:比較觀察野生型和突變型WISP3蛋白在人軟骨細(xì)胞株C20/A4中表達(dá)和定位的差別。 方法:以空白載體pEGF

4、P-C2為對照,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將帶綠色熒光蛋白的重組質(zhì)粒WT-WISP3/pEGFP-C2、MUT<'1000T/C>/pEGFP-C2和MUT<'840delT>/pEGFP-C2瞬時轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞株C20/A4,48h后用激光共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察上述質(zhì)粒的表達(dá)和定位。 結(jié)果:LSCM觀察發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染空白載體pEGFP-C2的C20/A4細(xì)胞中熒光均勻分布于整個細(xì)胞,轉(zhuǎn)染攜帶野生型WISP3基因質(zhì)粒WT-WISP3/pE

5、GFP-C2的C20/A4細(xì)胞中熒光均勻分布于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜,轉(zhuǎn)染攜帶突變WISP3基因質(zhì)粒MUT<'1000T/C>/pEGFP-C2和MUT<'840delT>/pEGFP-C2的C20/A4細(xì)胞中熒光在細(xì)胞漿中呈斑點(diǎn)狀染色和聚集現(xiàn)象。 結(jié)論:野生型WISP3蛋白定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜。突變的WISP3基因?qū)е缕涞鞍自诩?xì)胞漿內(nèi)異常濃聚可能是SEDT-PA發(fā)病的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)之一。 第二章WISP3基因突變體在軟骨細(xì)胞中

6、表達(dá)和功能的研究 目的：將構(gòu)建的WISP3基因突變體穩(wěn)定表達(dá)于人軟骨細(xì)胞株C20／A4中，觀察WISP3基因突變后在軟骨細(xì)胞中的功能變化。 方法：以空白載體pcDNA3.1(+)為對照，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒wT-WISP3／pcDNA3.1(+)、MUT<'1000T/C)／pcDNA3.1(+) 和MUT<'840delT>／pcDNA3.1(+)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人軟骨細(xì)胞株C20／A4，分別對轉(zhuǎn)染突變體的C20／

7、A4細(xì)胞、正常人和SEDT-PA患者的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期測定，用吖啶橙／溴化乙啶活細(xì)胞染色(AO／EB)和流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞凋亡率的變化。半定量RT-PCR測定轉(zhuǎn)染后的各組C20／A4細(xì)胞I、II型膠原(Collagen typeI，Collagen type II)，SOX9，纖維結(jié)合素(Fibronectin)和MMP-1等基因mRNA表達(dá)的變化。用Westem-blot檢測轉(zhuǎn)染后的各組C20／A4細(xì)胞WISP3和I

8、I型膠原蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：半定量RT-PCR和Western blot顯示，各重組質(zhì)粒在人軟骨細(xì)胞株C20／A4中均呈高效表達(dá)；轉(zhuǎn)染突變體的C20／A4細(xì)胞表現(xiàn)為增殖速度加快，增殖指數(shù)增高、DNA合成增多和凋亡減少，上述改變與SEDT-PA患者的軟骨細(xì)胞改變一致；轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-WISP3／pcDNA3.1(+)的C20／A4細(xì)胞能明顯增加Collagen type II的表達(dá)，而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染突變體質(zhì)粒MUT<'1000T/C>/pcD