人軟骨肉瘤細(xì)胞SW1353及WISP3突變型C20-A4軟骨細(xì)胞的Ⅱ型膠原動(dòng)力學(xué)及定位研究.pdf

1、與許多組織細(xì)胞不同，軟骨細(xì)胞在體外長(zhǎng)期貼壁培養(yǎng)(單層培養(yǎng))和傳代過程中，細(xì)胞形態(tài)與功能可發(fā)生顯著變化，細(xì)胞逐漸喪失合成Ⅱ型膠原和硫酸軟骨素蛋白多糖的能力，轉(zhuǎn)而分泌I型和Ⅲ型膠原，該變化被稱為“軟骨細(xì)胞的去分化(Dedifferentiation)現(xiàn)象”。從軟骨細(xì)胞脫離組織，在貼壁條件下培養(yǎng)開始，軟骨細(xì)胞即逐漸地發(fā)生去分化。近10余年來，因海藻酸鈉三維培養(yǎng)體系能很好模擬體內(nèi)環(huán)境，有效維持軟骨細(xì)胞的分化表型，廣泛應(yīng)用于軟骨細(xì)胞組織工程和軟骨

2、細(xì)胞生物學(xué)研究。SWl353軟骨細(xì)胞系是一種人軟骨肉瘤細(xì)胞株，常被用于軟骨細(xì)胞功能及相關(guān)疾病的研究。但是，對(duì)Swl353軟骨細(xì)胞的去分化現(xiàn)象，及其解決辦法尚無報(bào)道。我們比較了單層培養(yǎng)及海藻酸鈉三維培養(yǎng)的人軟骨肉瘤細(xì)胞Swl353的形態(tài)學(xué)和表型差異，其目的是觀察SWl353細(xì)胞在兩種培養(yǎng)體系中的表型差異。單層培養(yǎng)的SWl353細(xì)胞8周后有去分化改變，而海藻酸鈉三維培養(yǎng)體系8周后仍能很好維持軟骨細(xì)胞的固有表型。與單層培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)中的S

3、Wl353細(xì)胞增殖緩慢，Ⅱ型膠原合成和分泌低下，因而細(xì)胞的這種“休眠”狀態(tài)可能是三維培養(yǎng)狀態(tài)下軟骨細(xì)胞維持其固有表型的重要機(jī)制。本研究的新發(fā)現(xiàn)和新結(jié)論是：(1)首次研究了Swl353細(xì)胞的表型和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其II型膠原合成、分泌、、超微定位；(2)SWl353細(xì)胞和正常人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的形態(tài)和表型相類似，長(zhǎng)期單層培養(yǎng)8周后SWl353細(xì)胞發(fā)生去分化，海藻酸鈉三維培養(yǎng)能防止這種改變；(3)使細(xì)胞處于“休眠”狀態(tài)是海藻酸鈉三維培養(yǎng)體系維持軟

4、骨細(xì)胞固有表型的機(jī)制之一。 晚發(fā)型脊柱骨骺發(fā)育不良伴進(jìn)行性骨關(guān)節(jié)病 ( spondyloepiphyseal sdysplasia tarda with progressivearthropathy，SEDT-PA)是一種主要累及軟骨組織的常染色體隱性遺傳性疾病。研究證實(shí)，Wnt誘導(dǎo)分泌蛋白-3(Wnt-inducible secretedproteins，WISP3)基因?yàn)镾EDT-PA的致病基因。我們收集到一

5、個(gè)SEDT-PA家系，對(duì)其致病基因wISP3進(jìn)行了突變檢測(cè)。研究發(fā)現(xiàn)，兩名患者的WISP3基因外顯子8出現(xiàn)復(fù)合雜合性基因突變，一條來自父方，在WISP3第334位密碼子首位堿基出現(xiàn)T到C的錯(cuò)義突變(1000T→C)；另一條來自母方，在WISP3第280位密碼子的末位堿基出現(xiàn)缺失突變(840delT)導(dǎo)致截短蛋白。我們構(gòu)建了WISP3(840delT)突變型軟骨細(xì)胞C20／A4，分別同位素脈沖追蹤方法動(dòng)態(tài)觀察了WISP3突變型軟骨細(xì)胞C2

6、0／A4內(nèi)膠原的合成和分泌變化，用透視電鏡觀察該細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，用膠體金免疫電鏡觀察該細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)內(nèi)Ⅱ型膠原的定位，以探討SEDT-PA發(fā)病機(jī)制。 本研究的新發(fā)現(xiàn)和新結(jié)論有：(1)SWl353細(xì)胞、C20／A4細(xì)胞的 膠原合成和分泌的高峰一致，均為HC標(biāo)記的脯氨酸干預(yù)后180min；(2)WISP3突變型C20／A4細(xì)胞和WISP3過表達(dá)的C20／A4細(xì)胞出現(xiàn)膠原分泌和合成的高峰不一致或消失，這些改變可能是SEDT-

7、PA的重要發(fā)病機(jī)制之一。(3)WISP3突變型C20／A4細(xì)胞的線粒體的腫脹、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的擴(kuò)張，核膜皺縮。Ⅱ型膠原主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜，Ⅱ型膠原減少，分布不均勻。這些改變可能SEDT-PA發(fā)病的病理基礎(chǔ)。 目的；鑒定人軟骨肉瘤SWl353的細(xì)胞表型，研究II型膠原的合成和分泌等生物動(dòng)力學(xué)特征及其超微定位。 方法；單層培養(yǎng)原代人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及人軟骨肉瘤細(xì)胞SWl353一周后，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；用甲苯胺藍(lán)染色及II型膠

8、原免疫組化方法進(jìn)行軟骨細(xì)胞表型鑒定。用<'14>C標(biāo)記的脯氨酸干預(yù)SWl353細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)(30，60，120，180，240，300 min)收集細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解蛋白，用液體閃爍系統(tǒng)檢測(cè)膠原含量，用ELISA檢測(cè)II型膠原的含量，用免疫電鏡對(duì)II型膠原進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)定位。 結(jié)果 (1)SWl353細(xì)胞與正常人原代培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞類似，以多角形及星形細(xì)胞為主；(2)甲苯胺藍(lán)染色顯示兩種細(xì)胞的胞漿內(nèi)有紫藍(lán)色蛋白多糖異染。A

9、EC法免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漿的II型膠原為棕紅色。<'14>HC標(biāo)記的脯氨酸干預(yù)后180min膠原合成和分泌達(dá)高峰，(3)免疫電鏡觀察II型膠原主要定位于細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。 結(jié)論SWl353以多角形細(xì)胞為主，具有良好的軟骨細(xì)胞表型，可以用于軟骨細(xì)胞的功能研究。 目的；觀察長(zhǎng)期單層培養(yǎng)后人軟骨肉瘤細(xì)胞株SWl353細(xì)胞的表型改變，建立海藻酸鈉三維培養(yǎng)體系，比較單層培養(yǎng)和海藻酸鈉三維培養(yǎng)對(duì)軟骨細(xì)胞去分化的影響與差異。

10、 方法；SWl353細(xì)胞在單層貼壁培養(yǎng)條件下增殖到合適的細(xì)胞密度，轉(zhuǎn)入海藻酸鈉凝膠培養(yǎng)基質(zhì)中進(jìn)行三維培養(yǎng)，并設(shè)置單層培養(yǎng)做為對(duì)照：觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)并繪制生長(zhǎng)曲線。海藻酸鈉三維培養(yǎng)8w后，用檸檬酸鈉分解海藻酸鈉凝膠基質(zhì)，解離細(xì)胞，分別收集培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的海藻酸鈉基質(zhì)及上清，用甲苯氨藍(lán)染色、免疫組化、ELISA等檢測(cè)兩種軟骨細(xì)胞的形態(tài)、表型及II型膠原的合成能力。 結(jié)果 (1)培養(yǎng)8周后，單層的Swl353有去分化現(xiàn)象，而從海藻

11、酸鈉凝膠三維培養(yǎng)體系中解離出的細(xì)胞保持了良好的分化表型。(2)三維培養(yǎng)液及海藻酸鈉基質(zhì)中的II型膠原表達(dá)量較8周前明顯降低。(3)單層培養(yǎng)的SWl353細(xì)胞增殖活躍而藻酸鈉內(nèi)的細(xì)胞增殖緩慢。 結(jié)論長(zhǎng)期單層培養(yǎng)的SWl353細(xì)胞發(fā)生去分化，而海藻酸鈉凝膠三維培養(yǎng)體系能良好地維持SWl353細(xì)胞的軟骨細(xì)胞表型。三維培養(yǎng)中，細(xì)胞II型膠原代謝率低、增殖緩慢，這種“休眠”狀態(tài)是維持軟骨細(xì)胞表型的重要機(jī)制。 目的； 動(dòng)態(tài)觀察WI

12、SP3突變體軟骨細(xì)胞C20／A4的II型膠原合成和分泌特點(diǎn)，觀察其在細(xì)胞內(nèi)的超微定位，和超微結(jié)構(gòu)變化。 方法；用脈沖追蹤法，在<'14>C標(biāo)記的脯氨酸干預(yù)WISP3突變體軟骨細(xì)胞C20／A4后的不同時(shí)間點(diǎn)(30，60，120，180，240，300min)收集細(xì)胞上清和細(xì)胞內(nèi)蛋白，用液體閃爍系統(tǒng)檢測(cè)膠原含量，用ELISA檢測(cè)II型膠原的量。用透視電鏡觀察突變型細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化，用膠體金免疫電鏡觀察II型膠原在突變型細(xì)胞內(nèi)的超微

13、定位。 結(jié)果(1)SWl353細(xì)胞及C20／A4細(xì)胞株在<'14>C標(biāo)記的脯氨酸干預(yù)后180min，分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清的膠原及細(xì)胞內(nèi)合成的膠原同時(shí)達(dá)到高峰；(2)與SWl353細(xì)胞及C20／A4細(xì)胞株比較，<'14>C標(biāo)記的脯氨酸干預(yù)后，WISP3突變型C20／A4細(xì)胞內(nèi)的II型膠原合成高峰提前到120 min，而WISP3過表達(dá)的C20／A4細(xì)胞膠原合成沒有明顯峰值，膠原分泌高峰均提前到120min，膠原合成和分泌不同步。(3