巨頜癥致病基因SH3BP2突變體對成纖維細胞的增殖抑制作用研究.pdf

1、巨頜癥(cherubism，MIM118400)于1933年首次被美國學(xué)者Jones進行報道。為一種罕見的疾病，是由良性頜骨發(fā)育不良導(dǎo)致的，典型癥狀為雙側(cè)頜骨的對稱性腫大。頜骨腫大是由于過度吸收的骨組織被炎性纖維結(jié)締組織替代，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的面部畸形。典型的病變一般開始于2-5歲的兒童，發(fā)生骨吸收和面部腫脹，持續(xù)到青春期，在大多數(shù)病例青春期以后病變自發(fā)靜止，此后也可自行修復(fù)。但是也有少數(shù)患者病變并不停止。患者常伴有牙發(fā)育異常，導(dǎo)致咬合關(guān)系

2、紊亂，影響患者語言、吞咽、咀嚼和呼吸等功能，有的還可引起阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征，嚴(yán)重者可同時累及上頜骨，擴展至眼眶引起復(fù)視、視力減退等并發(fā)癥。加之，研究已經(jīng)證實，該病為常染色體顯性遺傳性疾病，故巨頜癥的預(yù)防及理想的生物學(xué)治療方法研究便成了眾多學(xué)者密切關(guān)注和一直致力探索的目標(biāo)，這也成了本課題組關(guān)注的研究目標(biāo)。
　　已有研究確定位于染色體4p16.3區(qū)域的SH3BP2基因為巨頜癥的致病基因。目前已發(fā)現(xiàn)十幾種突變類型，大多數(shù)突變位于S

3、H3BP2基因第9外顯子上，僅有兩例位于第3、4外顯子，突變的堿基使其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，導(dǎo)致巨頜癥的發(fā)生。于2006年本課題組首先報道了一種新的點突變，為第9外顯子上基因編碼區(qū)第1256位堿基堿基由A突變?yōu)镚，導(dǎo)致其編碼的蛋白由Asp突變?yōu)镚ly。
　　SH3BP2編碼的蛋白是一種接頭蛋白，最早是通過掃描小鼠的包含有Sre同源3結(jié)構(gòu)域(Srehomology3domain，SH-3)融合蛋白的cDNA文庫時被發(fā)現(xiàn)的。巨頜癥

4、的頜骨骨組織過度吸收為巨頜癥的一大特點，有研究者報道，當(dāng)其表達在小鼠單核細胞系Raw264.7中被敲低后，Raw264.7分化為成熟的破骨細胞的過程障礙，提示它在破骨細胞的分化過程中起重要作用。巨頜癥中的SH3BP2突變蛋白能夠上調(diào)破骨前體細胞對破骨細胞分化因子(receptoractivorofNF-Kbligand，RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(macrophagecolony-stimulatingfactors，M-CSF

5、)的應(yīng)答，表明其為功能獲得型突變。SH3BP2還能調(diào)節(jié)活化破骨細胞分化所必需的轉(zhuǎn)錄因子T細胞核因子1蛋白(NFATc1)的活性;多數(shù)SH3BP2堿基替換突變的蛋白不與14-3-3伴侶蛋白結(jié)合，從而可以持續(xù)發(fā)揮刺激破骨細胞分化的功能。巨頜癥中被破壞的骨組織被增生性炎癥纖維組織替代，因此局部頜骨纖維化也是巨頜癥的重要組織學(xué)特點，而該過程中成纖維細胞的生長狀態(tài)可能受到單核-巨噬細胞等調(diào)控，但這種調(diào)控是否受SH3BP2的影響目前尚不清楚。明確這

6、些問題，有助于了解SH3BP2突變?nèi)绾螀⑴c巨頜癥結(jié)締組織反應(yīng)，為探討緩解癥狀和患者面部畸形的生物干預(yù)方法提供理論支持。
　　第一部分突變型SH3BP2真核表達載體的構(gòu)建及其穩(wěn)定過表達Raw264.7細胞系的建立
　　目的:為了實現(xiàn)體外研究巨頜癥致病基因SH3BP2點突變導(dǎo)致的功能改變，明確其纖維異常增生的發(fā)生機制，體外建立SH3BP2突變(c.1256A＞G)突變體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。
　　方法:采用定點突變方法，成功構(gòu)

7、建了巨頜癥致病基因SH3BP2突變(c.1256A＞G)真核表達載體，通過測序予以鑒定;用野生型和突變型真核表達載體分別轉(zhuǎn)染單核細胞系Raw264.7，通過G418篩選過表達穩(wěn)定株，挑取單克隆細胞團并擴增;用Westernblott和RealtimePCR技術(shù)檢測蛋白的表達水平。
　　結(jié)果:(1)突變質(zhì)粒構(gòu)建通過BLAST比對，除第1256位堿基，SH3BP2測序結(jié)果與NM_003023SH3BP2蛋白翻譯區(qū)核酸序列一致，第125

8、6位堿基已成功由A突變?yōu)镚，與本課題組之前報道突變型SH3BP2序列相一致;
　　(2)轉(zhuǎn)染真核過表達載體并G418篩選后的克隆團，體積小而圓，野生型和突變型SH3BP2過表達的Raw264.7細胞外形無明顯差異。WesternBlott和RealtimePCR結(jié)果均顯示:相對于未轉(zhuǎn)染組，野生型、突變型SH3BP2基因轉(zhuǎn)染組中各有8個克隆SH3BP2蛋白表達水平明顯增高，P＜0.01。
　　結(jié)論:(1)本實驗成功構(gòu)建了突變型

9、(c.1256A＞G)SH3BP2真核表達載體;
　　(2)成功建立了穩(wěn)定過表達突變型(p.Asp419Gly)和野生型SH3BP2的Raw264.7細胞系。
　　第二部分SH3BP2突變體對成纖維細胞增殖抑制作用的研究
　　目的:用突變型和野生型Raw264.7過表達穩(wěn)定株條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)小鼠頜骨及長骨成纖維細胞。用兩組穩(wěn)定株的條件培養(yǎng)基探討巨頜癥突變的破骨細胞前體細胞的旁分泌對頜骨及長骨骨髓基質(zhì)中的成纖維樣細胞增殖

10、的影響。
　　方法:分別制備突變型和野生型Raw264.7過表達穩(wěn)定株條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)P2代4W雄性BALB/c小鼠頜骨來源成纖維樣細胞和長骨來源的成纖維細胞，CCK-8試劑盒檢測兩種成纖維細胞增殖曲線。
　　結(jié)果:過表達突變型蛋白組的條件培養(yǎng)基中成纖維細胞減少速率小于野生型組(P＜0.05)。兩種條件培養(yǎng)基對頜骨成纖維細胞增殖抑制作用均強于長骨成纖維細胞。
　　結(jié)論:與過表達野生型SH3BP2的單核細胞相比，過表達突