載5-FU聚乳酸納米微粒對人Tenon囊成纖維細(xì)胞抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究通過觀察載5-FU聚乳酸納米微粒(5-fluorouracil-loaded polylactic acid-nanoparticles，5-FU-PLA-NPs)對體外培養(yǎng)的人Tenon囊成纖維細(xì)胞和Ⅲ型前膠原蛋白的作用效果，為進(jìn)一步偶聯(lián)特異抗體制備載5-FU免疫納米控釋系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)，力圖尋找一種新型安全有效的防治青光眼手術(shù)區(qū)濾過泡纖維瘢痕化的新途徑，最大限度地提高青光眼手術(shù)成功率。 研究方法： 1、體外人眼Te

2、non囊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。 2、MTT比色法檢測不同劑量(0.1mg/L，lmg/L，10mg/L，100mg/L，1000mg/L)的空載聚乳酸納米微粒(PLA-NPs)在不同時(shí)間點(diǎn)(48h、72h)對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖的影響，評(píng)價(jià)聚乳酸的生物相容性。 3、MTT比色法檢測不同劑量(0.1mg/L，1mg/L，10mg/L，100mg/L，1000mg/L)5-FU-PLA-NPs和5-FU在1～7d

3、內(nèi)共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)對成纖維細(xì)胞生長的抑制作用，計(jì)算并比較2種藥物在7個(gè)時(shí)間點(diǎn)對成纖維細(xì)胞的抑制率。 4、半定量RT-PCR分別檢測劑量為100mg/L的5-FU-PLA-NPs和5-FU作用成纖維細(xì)胞1d、5d、7d后Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達(dá)情況。 研究結(jié)果： 1、人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定 1．1組織塊培養(yǎng)法和混合消化酶培養(yǎng)法均成功培養(yǎng)出人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞，細(xì)胞成典型的長梭形。

4、 1．2Vimentin染色免疫化學(xué)鑒定均可見陽性物質(zhì)分布于胞漿中，形態(tài)學(xué)和細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定證明所培養(yǎng)的細(xì)胞是人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞。 2、MTT比色法評(píng)價(jià)空載聚乳酸納米微粒(PLA-NPs)對人眼Tenon囊成纖維細(xì)胞的增殖影響 PLA-NPs與對照組分別作用成纖維細(xì)胞48h、72h后OD值的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，倒置光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)沒有變化。 3、MTT比色法評(píng)價(jià)5-FU-PLA-NP

5、s與5-FU原藥對Tenon囊成纖維細(xì)胞增殖的影響 5-FU-PLA-NPs和5-FU原藥作用成纖維細(xì)胞1～7d的OD值與對照組的OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩者均對成纖維細(xì)胞有抑制作用，具有時(shí)間和劑量依賴性。第1～3d各濃度及第4d低濃度(0.1mg/L，1mg/L，10mg/L)的5-FU-PLA-NPs OD值與5-FU原藥OD值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，5-FU-PLA-NPs的抑制作用弱于5-

6、FU原藥。第4d，高濃度(100mg/L，1000mg/L)，第5、6d各濃度5-FU-PLA-NPs和5-FU原藥OD值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，兩者對成纖維細(xì)胞的抑制作用無差別。第7d，5-FU-PLA-NPs對成纖維細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于5-FU原藥組，其OD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 4、RT-PCR檢測5-FU-PLA-NPs和5-FU原藥對成纖維細(xì)胞Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達(dá) LSD-t檢驗(yàn)

7、統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：作用1d、5d、7d，PLA-NPs組與對照組Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達(dá)水平無差別(P>0.05)；而5-FU-PLA-NPs組、5-FU原藥組Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達(dá)均低于對照組(P=0.000)：作用1d、5d，5-FU原藥組Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達(dá)水平較5-FU-PLA-NPs組低(P<0.05)，作用7d，5-FU-PLA-NPs組Ⅲ型前膠原蛋白mRNA的表達(dá)水平較5-FU原藥組低(P<0.05)。

8、 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：聚乳酸具有良好的生物相容性與安全性；5-FU-PLA-NPs和5-FU原藥均對體外培養(yǎng)的人。Tenon囊成纖維細(xì)胞具有抑制作用，并使Ⅲ型前膠原蛋白 mRNA的表達(dá)水平降低；該抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性，隨著作用時(shí)間的延長，5-FU-PLA-NPs對成纖維細(xì)胞的抑制作用超過原藥，提示5-FU-PLA-NPs具有一定的緩釋功能，本實(shí)驗(yàn)為其進(jìn)一步偶聯(lián)特異性抗體制備靶向載藥納米微粒，行體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，為最終提高青光眼手術(shù)成功率