10-羥基喜樹堿對RA滑膜成纖維細胞的抑制作用.pdf

1、背景及目的：
　　類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，R.A）是一種慢性的炎癥性疾病，以滑膜異常增殖、關(guān)節(jié)破壞及滑膜免疫細胞浸潤為主要特征，包括淋巴細胞、巨噬細胞、樹突細胞等。該病主要表現(xiàn)在關(guān)節(jié)受累上，最終可造成關(guān)節(jié)破壞、畸形，肢體活動障礙，為家庭及社會增加了沉重的經(jīng)濟負擔和心理負擔。故早期的發(fā)現(xiàn)并及時的治療、控制疾病的進展，成為重中之重。人類經(jīng)過多年對RA臨床表現(xiàn)的了解，及對其發(fā)病機制的探索，明白了RA具有類

2、似于“局部惡性腫瘤”的增生性和破壞性的特點，T淋巴細胞、滑膜成纖維細胞（Fibroblast-like Synoviocytes,FLS）異常的增殖這一特點是這一病變根本。盡管對該病的發(fā)病機理有了一定的了解，仍不能滿足目前的醫(yī)療需求。長期以來，甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）主要作為RA治療的首選藥物，但一部分患者不能耐受MTX，因其具有明顯的胃腸道反應（如惡心、嘔吐）、肝功能損害、骨髓抑制等，給RA的治療帶來了困難。因此非

3、常有必要尋找一種有效的、經(jīng)濟的、毒副作用小的藥物來替代 MTX，亦或是與其作用相當。10-羥基喜樹堿（10-Hydroxycamptot.hecine,10-HCPT）是一種普遍應用于多種惡性腫瘤的抗腫瘤藥物。經(jīng)臨床驗證，效果較為明確，毒副作用較少。我們前期從動物實驗及體外實驗兩方面均證實，在RA中，10-HCPT對T淋。巴細胞的功能具有明顯的抑制作用。從抑制細胞增殖方面來說，10-HCPT或許可以成為治療RA的藥物。本研究從FLSs方

4、面著手，探討10-HCPT對體外培養(yǎng)的FLSs增殖及功能的抑制作用，為10-HCPT成為治療RA的有效藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.收集北京大學人民醫(yī)院行關(guān)節(jié)置換術(shù)或滑膜切除術(shù)的RA患者的關(guān)節(jié)滑膜組織，進行細胞培養(yǎng)。
　　2.分組：分別用不同濃度10-HCPT、MTX處理細胞，采用MTX作為陽性對照組，不加藥物組作為空白對照組。
　　3.檢測細胞增殖抑制情況采用CCK-8（Cell Counting K

5、it-8）法。設(shè)置不同的時間梯度、不同濃度梯度，對比10-HCPT與MTX抑制FLSs增殖的情況。
　　4.檢測細胞凋亡情況采用流式細胞術(shù)法。不同的時間梯度、不同濃度梯度，對比10-HCPT與MTX對FLSs誘導凋亡的情況。
　　5.酶聯(lián)免疫吸附方法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測不同的作用時間，不同濃度的FLSs分泌血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endotheli

6、al growth factor，VEGF）的水平。
　　6.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈法（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測不同的作用時間，不同濃度的FLSs表達基質(zhì)金屬蛋白酶3-mRNA（matrix metalloproteinase,MMP3；Messenger Ribonucleic Acid，mRNA）的水平。
　　7.應用SPSS16.0、Fl

7、owjo軟件進行統(tǒng)計分析。
　　結(jié)果：
　　1.10-HCPT可明顯抑制RA-FLSs的增殖，其抑制作用與MTX作用相當（劑量0.1μɡ/ml、1.0μɡ/ml，作用時間24h，P>0.05）。與MTX相比，隨著劑量的增大（5.0μɡ/ml、10.0μɡ/ml），作用時間的延長（48h、72h），10-HCPT的抑制作用更強（P<0.05）。
　　2.10-HCPT具有較MTX更強的誘導FLSs凋亡的作用，隨著劑量增大

8、，誘導凋亡作用隨之增強（P<0.05）。
　　3.用不同濃度10-HCPT及MTX處理FLSs后，VEGF表達量高低不同。與空白對照組相比，10-HCPT高、低濃度組VEGF表達量均顯著降低（P<0.05），MTX高、低濃度組則無明顯差異（P>0.05）。10-HCPT高、低濃度組與MTX低濃度組比較，VEGF表達量顯著降低（P<0.05）。10-HCPT高濃度組與MTX高濃度組比較，VEGF表達量顯著降低（P<0.05）。

9、>　　4.與空白對照組比較，不同濃度的10-HCPT及MTX組，MMP3 mRNA表達水平均降低。其中兩種藥物的高濃度組與對照組比較，MMP3 mRNA表達顯著降低（P<0.01）。與10-HCPT低濃度組比較，10-HCPT及MTX高濃度組MMP3 mRNA表達均降低（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.10-HCPT具有顯著的抑制FLSs增殖、誘導其凋亡、抑制細胞分泌VEGF、抑制細胞表達MMP3 mRNA的作用。