PAMAM-eIF4E-shRNA納米微粒對人肝癌細(xì)胞抑制作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是我國最常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后很差，發(fā)現(xiàn)時(shí)多屬晚期，五年生存率較低，目前的放化療及手術(shù)均效果不佳，探索新的肝癌治療手段具有重要價(jià)值。
　　 真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors，eIFs)在真核細(xì)胞翻譯起始階段有重要作用。該家族的eIF4E可特異性地與mRNA5'

2、帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppN)結(jié)合并調(diào)節(jié)mRNA翻譯表達(dá)，高表達(dá)于多種實(shí)體腫瘤細(xì)胞(如頭頸部鱗癌、喉癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌、膽管癌、結(jié)腸癌等)，其高表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。
　　 小分子干擾RNA(small interferencing RNA，siRNA)具有特異、高效沉默靶基因的特點(diǎn)，有望成為腫瘤治療最有前景的特異性基因藥物[2]。
　　 PAMAM-Dendrimer(聚酰胺

3、-胺型樹枝狀分子，PAMAM-D)是一種新型納米載體，呈樹枝狀結(jié)構(gòu)，其外層端基-NH2可質(zhì)子化成為-NH3+，表面攜帶正電荷，能與天然狀態(tài)下存在的帶負(fù)電荷的生物活性物質(zhì)發(fā)生靜電相互作用，形成復(fù)合物。具有攜帶量大、攜帶力強(qiáng)、透過細(xì)胞膜能力更強(qiáng)、緩釋性更好、對人體毒性更小等多方面的優(yōu)點(diǎn)，比以往采用的PLGA等納米載體更有優(yōu)勢[3]。
　　 本研究在體外設(shè)計(jì)合成針對eIF4E基因的短發(fā)夾RNA(shRNA)，篩選出沉默該基因表達(dá)的有效

4、片斷，利用對人體毒性較小的新型納米載體聚酰胺-胺型樹狀高聚物PAMAM-D攜帶該shRNA分子，并將其導(dǎo)入細(xì)胞。在人肝癌細(xì)胞水平觀察該納米載體介導(dǎo)的針對eIF4E的shRNA(PAMAM-eIF4E-shRNA納米微粒)對肝癌細(xì)胞eIF4E基因表達(dá)的影響，及其對肝癌細(xì)胞的抑制作用，為開發(fā)新的抗肝癌基因藥物提供思路。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、檢測eIF4E在肝腫瘤細(xì)胞和人肝癌組織中的差異表達(dá)
　　 Wester

5、n Blot法檢測人正常成熟肝細(xì)胞、人肝腫瘤細(xì)胞株HepG2、Hep3B、Huh7中eIF4E蛋白的表達(dá)情況。免疫組織化學(xué)法檢測46組人肝癌組織及其癌旁組織中eIF4E的蛋白表達(dá)水平。
　　 二、構(gòu)建針對eIF4E的PAMAM-eIF4E-shRNA載體復(fù)合物
　　 用RNAi設(shè)計(jì)軟件，從人eIF4E mRNA編碼區(qū)(GenBankNMBC035166)的起始密碼子(AUG)下游尋找兩條以“AA”開始的二聯(lián)序列，設(shè)計(jì)合成

6、長度為2Ints的兩條序列，并設(shè)計(jì)一對非特異性序列作為對照，與人類基因組進(jìn)行BLAST比對，驗(yàn)證其均為單一基因。合成以上寡核苷酸DNA單鏈，然后退火連接形成雙鏈shRNA。
　　 室溫下，不含血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，分別加入shRNA和PAMAM-D載體、shRNA和脂質(zhì)體，混合反應(yīng)后，分別得到PAMAM-shRNA和脂質(zhì)體-shRNA復(fù)合物。
　　 三、針對eIF4E的PAMAM-D-shRNA載體復(fù)合物轉(zhuǎn)染肝

7、癌細(xì)胞，檢測下調(diào)eIF4E表達(dá)對肝腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性(增殖和凋亡)的影響
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 37℃，5％CO2，將脂質(zhì)體-shRNA和PAMAM-shRNA復(fù)合物分別與肝癌細(xì)胞共育。
　　 2、Real Time PCR法檢測eIF4E mRNA表達(dá)
　　 抽提細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備eDNA，然后進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增，在圖像分析儀上對RT-PCR結(jié)果采用儀器自帶軟件ABI Pri

8、sm7300 SDS Software進(jìn)行圖像分析。
　　 3、噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞活力
　　 接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后分為兩組，分別加入脂質(zhì)體-shRNA和PAMAM-eIF4E-shRNA。實(shí)驗(yàn)時(shí)每孔加MTT20ul，作用四小時(shí)。分別于加入shRNA后第1，2，3，4，5，6，7天進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞相對抑制率(％)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD/對照組OD)×100％。
　　 4、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率

9、
　　 利用P1檢測細(xì)胞周期，用TUNEL法進(jìn)行細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞儀分析。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，結(jié)果用x±SD表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為具有顯著性差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、eIF4E在肝腫瘤細(xì)胞株和肝癌組織中的表達(dá)較癌旁組織和正常肝組織的表達(dá)高
　　 1、Westem Blot法檢測人正常成熟肝細(xì)胞、

10、不同人肝腫瘤細(xì)胞株eIF4E基因表達(dá)，顯示各肝癌細(xì)胞株均有eIF4E蛋白的高表達(dá)，尤其在HepG2細(xì)胞株中表達(dá)水平最高。正常細(xì)胞L02也有eIF4E蛋白表達(dá)，但水平較低。
　　 2、免疫組織化學(xué)法檢測病理組織蠟塊46組，其中32組人肝癌組織eIF4E蛋白表達(dá)水平較癌旁組織高，6組無明顯差異，8組人肝癌組織中eIF4E蛋白表達(dá)水平較癌旁組織低。
　　 二、成功構(gòu)建針對eIF4E的PAMAM-D-shRNA載體復(fù)合物

11、　　 根據(jù)shRNA設(shè)計(jì)原則，合成特異性DNA片段。然后退火，合成轉(zhuǎn)錄DNA模板，轉(zhuǎn)錄，純化。將合成的shRNA與PAMAM-D載體以1μg shRNA：0.65μg PAMAM-D的比例共育，兩者通過靜電作用結(jié)合，形成PAMAM-eIF4E-shRNA載體復(fù)合物。
　　 三、下調(diào)eIF4E表達(dá)抑制肝腫瘤細(xì)胞增殖
　　 1、Real Time PCR法檢測eIF4E mRNA表達(dá)
　　 同樣的條件下，PAMAM

12、-eIF4E-shRNA組對肝癌細(xì)胞HepG2的eIF4E基因表達(dá)水平下調(diào)作用更強(qiáng)，推測PAMAM-D作為shRNA的載體具有更高的轉(zhuǎn)染效率。
　　 2、噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞活力
　　 MTT實(shí)驗(yàn)的第1，2，3，4，5，6，7天，P均＜0.05，表示差異有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，PAMAM-eIF4E-shRNA組對肝癌細(xì)胞有更高的抑制率。
　　 3、PI檢測細(xì)胞周期
　　 S期，PAMAM-D介導(dǎo)組的細(xì)胞凋

13、亡率較脂質(zhì)體介導(dǎo)組明顯增高，PAMAM-eIF4E-shRNA對肝癌細(xì)胞有更高的抑制率。
　　 4、凋亡細(xì)胞的TUNEL的流式細(xì)胞儀分析
　　 TUNEL法檢測細(xì)胞，PAMAM-eIF4E-shRNA組細(xì)胞凋亡指數(shù)高于脂質(zhì)體組。P為0.013，P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1、在HepG2等肝癌細(xì)胞株及大部分人肝癌組織中，eIF4E表達(dá)水平明顯增高。
　　 2、PAMA