納米微載體介導(dǎo)小干擾RNA調(diào)控人Tenon’s囊成纖維細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的： 本課題旨在利用RNA干擾技術(shù)結(jié)合高分子納米材料研究的最新成果，通過特異性下調(diào)人Tenon's囊成纖維細(xì)胞中IKKB基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活性，達(dá)到調(diào)控細(xì)胞因子和生長因子的分泌，控制成纖維細(xì)胞的增殖、移行、分泌及表型轉(zhuǎn)化能力，從而平衡調(diào)控青光眼濾過手術(shù)后濾過道局部創(chuàng)口愈合過程的目的；探討采用生物調(diào)節(jié)方式平衡調(diào)控青光眼濾過手術(shù)后功能性濾過道形成與局部創(chuàng)口愈合過程的可行性、有效性及其具體的作用機(jī)制，為最終實(shí)現(xiàn)青

2、光眼濾過性手術(shù)成功率的提高提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定：取角膜移植供體眼球的Tenon's囊組織，采用組織塊培養(yǎng)法體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞；免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞是否表達(dá)成纖維細(xì)胞的特征型抗原；透射電鏡下觀察所培養(yǎng)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。 2.RNA干擾轉(zhuǎn)染用新型納米微載體的合成與篩選：設(shè)計(jì)并人工合成用于轉(zhuǎn)染小干擾RNA進(jìn)入人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的陽離子納米聚合物

3、CS-g-(PEI600-g-PEG)及CS-g-(PEI1800-g-PEG)，利用ZetasizerNano動(dòng)態(tài)光散射儀測(cè)量其與siRNA結(jié)合后形成的納米微球的粒徑；電泳遷移法檢測(cè)其結(jié)合siRNA的能力；流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡檢測(cè)其轉(zhuǎn)染siRNA的效率：MTT法檢測(cè)其細(xì)胞毒性。通過以上檢測(cè)指標(biāo)篩選出與siRNA結(jié)合能力較強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率較高、細(xì)胞毒性較小的納米材料作為siRNA轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的微載體。 3.篩選

4、靶向IKKB基因的高效siRNA：設(shè)計(jì)并人工合成靶向IKKB基因的siRNAs三對(duì)，以100nM的相同濃度在新型納米微載體的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞，利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IKKB的mRNA表達(dá)水平，篩選出具有較高RNA干擾效率的siRNA。 4.IKKB-siRNA轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞后RNA干擾效應(yīng)的檢測(cè)：將IKKB-siRNA以不同濃度(5nM，10nM，25nM，50nM，100nM)轉(zhuǎn)染人T

5、enon's囊成纖維細(xì)胞，用realtimeRT-PCR法檢測(cè)RNA干擾24小時(shí)后IKKB的mRNA表達(dá)水平；用Westernblot法檢測(cè)RNA干擾72小時(shí)后IKKB的蛋白表達(dá)水平；免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)RNA干擾72小時(shí)后NF-κB活性的變化。 5.IKKB-siRNA調(diào)控人Tenon's囊成纖維細(xì)胞增殖的檢測(cè)以及與絲裂霉素抗增殖作用的比較：將IKKB-siRNA以不同濃度(5nM，10nM，25nM，50n

6、M，100nM)轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞，同時(shí)設(shè)不同濃度(0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.8mg/ml)的絲裂霉素處理組，用CellTiter96()細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖程度的改變，分別繪制量效曲線；倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化；透射電子顯微鏡下觀察并比較RNA干擾組和絲裂霉素處理組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 6.靶向IKKB基因的RNA干擾對(duì)人Tenon's囊成纖

7、維細(xì)胞生物學(xué)行為影響的分析：IKKB-siRNA轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞后，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)處于不同細(xì)胞周期亞群的比例；免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)合激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)RNA干擾后細(xì)胞α-SMA的表達(dá)變化，以及collagenI分泌的改變；劃痕法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。 結(jié)果： 1.成功進(jìn)行了人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)，觀察到傳代3-6代的細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，核較大，胞漿豐富，呈漩渦狀排列生長，增殖能力強(qiáng)。免疫

8、細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)呈Vimentin、Fibronectin染色陽性。 2.通過對(duì)人工合成的兩種納米材料進(jìn)行siRNA結(jié)合能力、轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞毒性的測(cè)試，篩選出其中一種具有較強(qiáng)的siRNA結(jié)合能力、較高的轉(zhuǎn)染效率及較小的細(xì)胞毒性，化學(xué)成分為CS-g-(PEI600-g-PEG)的納米材料作為轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的微載體。 3.設(shè)計(jì)合成的三對(duì)siRNAs轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞24小時(shí)后，經(jīng)RT

9、-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其中一對(duì)siRNA對(duì)IKKB的mRNA表達(dá)抑制程度最高。 4.以不同濃度的IKKB-siRNA轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞后，realtimeRT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RNA干擾24小時(shí)后IKKB的mRNA表達(dá)水平隨siRNA濃度的增加而降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Westernblot法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RNA干擾72小時(shí)后IKKB的蛋白表達(dá)水平亦隨siRNA濃度的增加而降低。 5.激光共聚焦顯微

10、鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)靶向IKKB基因的RNA干擾后NF-κB的活化受到了抑制，活化并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB顯著減少。 6.CellTiter96()細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)以不同濃度的IKKB-siRNA轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞后，細(xì)胞的增殖程度隨siRNA濃度的增加而降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，達(dá)到最高抑制率時(shí)RNA干擾不會(huì)造成絲裂霉素處理組所見的細(xì)胞壞死或凋亡。 7.IKKB-

11、siRNA轉(zhuǎn)染人Tenon's囊成纖維細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)處于G0/G1期的細(xì)胞亞群比例增加，而處于G2/M期的細(xì)胞亞群比例降低；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)RNA干擾后細(xì)胞胞漿中α-SMA的表達(dá)減少，collagenI的分泌減少；劃痕法檢測(cè)顯示細(xì)胞遷移能力降低。 結(jié)論： 1.人工合成的陽離子聚合物CS-g-(PEI600-g-PEG)，具有siRNA結(jié)合能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小的特點(diǎn)，可以作為轉(zhuǎn)染siRNA進(jìn)入

12、人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的微載體。 2.通過靶向IKKB基因的RNA干擾，可以高效抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白激酶β(即IKKB)的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控NF-κB的活性，減少活化并進(jìn)入細(xì)胞核的NF-κB的數(shù)量。 3.通過靶向IKKB基因的RNA干擾，能夠抑制體外培養(yǎng)的人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的增殖，且抑制的程度隨轉(zhuǎn)染siRNA濃度的增加而加大，達(dá)到最高抑制率的同時(shí)，未對(duì)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)造成影響。 4.通過靶向IKK