納米微載體介導(dǎo)小干擾RNA調(diào)控恒河猴濾過(guò)術(shù)區(qū)瘢痕化的研究.pdf

1、目的:
　　 本課題旨在應(yīng)用RNA干擾技術(shù),以IKKβ為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)合成siRNA,由納米微載體CS-g-(PEI-b-mPEG)介導(dǎo),在恒河猴動(dòng)物模型觀察其對(duì)濾過(guò)術(shù)后疤痕化的調(diào)控作用和安全性。
　　 方法:
　　 設(shè)計(jì)并合成靶向恒河猴IKKβ的siRNA三對(duì),以100nM的相同濃度在納米微載體CS-g-(PEI-b-mPEG)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染猴Tenon's囊成纖維細(xì)胞,RT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后IKKβ的mRNA表達(dá)水

2、平,篩選出具有較高RNA干擾效率的siRNA。
　　 將篩選出的siRNA以不同濃度(5nM,10nM,25nM,50nM,100nM)轉(zhuǎn)染猴Tenon's囊成纖維細(xì)胞,使用real time RT-PCR檢測(cè)干擾后IKKβ的mRNA的表達(dá)水平,Western blot法檢測(cè)干擾后IKKβ的蛋白表達(dá)水平,同時(shí)MTT法檢測(cè)不同濃度對(duì)成纖維細(xì)胞增殖能力的影響。細(xì)胞劃痕法觀察對(duì)成纖維細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 制作恒河猴濾過(guò)手

3、術(shù)模型,并隨機(jī)分為3組:siRNA組(6只)、MMC組(4只)以及PBS組(4只)。其中siRNA組分別于術(shù)畢即刻和術(shù)后7天,濾過(guò)區(qū)球結(jié)膜下注射0.1ml的CS-g-(PEI-b-mPEG)/IKKβ-siRNA(溶解于無(wú)RNA酶水,濃度50nM),MMC組(0.2mg/ml)和PBS組分別為陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。術(shù)后觀察時(shí)間點(diǎn)為:3d、7d、10d、14d、17d、21d、24d、28d、31d、35d、42d、49d、56d及60d,

4、行常規(guī)裂隙燈檢查、濾過(guò)泡評(píng)估以及眼壓測(cè)量；術(shù)后60d,每組分別取2眼,術(shù)區(qū)HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。
　　 結(jié)果
　　 經(jīng)篩選出最高效的IKKβ-siRNA以濃度5nM、10nM、25nM、50 nM、100 nM轉(zhuǎn)染猴Tenon's囊成纖維細(xì)胞后,猴Tenon's囊成纖維細(xì)胞中IKKβ的mRNA表達(dá)水平隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增加而逐漸降低,與空白對(duì)照組相比,各濃度組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。蛋白表達(dá)量也

5、隨著siRNA轉(zhuǎn)染濃度的增加而逐漸降低。與空白對(duì)照組相比較,各濃度組對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),50nM的濃度處理組對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的抑制已達(dá)到平臺(tái)期。細(xì)胞劃痕法檢測(cè)示細(xì)胞遷移能力受到抑制。
　　 在恒河猴濾過(guò)手術(shù)模型中,siRNA組結(jié)膜下注射CS-g-(PEI-b-mPEG)/IKKβ-siRNA具有良好的眼內(nèi)相容性,與MMC組以及PBS組相比,未發(fā)生明顯毒副作用。與PBS組相比,siRNA組

6、的濾過(guò)泡生存時(shí)間明顯延長(zhǎng),PBS組、siRNA組及MMC組濾過(guò)泡生存時(shí)間的中位數(shù)分別為29.5天、45.5天和60天。siRNA組和MMC組濾過(guò)泡面積明顯大于PBS組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),而siRNA組和MMC組之間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.214)。siRNA組的濾過(guò)泡高度明顯大于PBS組(P<0.01),而MMC組的濾過(guò)泡高度最大(P<0.01)。PBS組在術(shù)后31日以后,眼壓和術(shù)前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,siRNA組

7、在術(shù)后42日眼壓和術(shù)前相比具有顯著性差異,MMC組在術(shù)后各觀察點(diǎn)的眼壓和術(shù)前相比均具有顯著性差異。組織學(xué)檢查顯示較PBS組,siRNA組能明顯抑制濾過(guò)區(qū)結(jié)膜下纖維化,抑制結(jié)膜下膠原纖維的形成,但沒(méi)有顯示MMC組的彌漫性結(jié)膜上皮變薄等過(guò)度抑制現(xiàn)象。
　　 結(jié)論:
　　 以納米微載體CS-g-(PEI-b-mPEG)介導(dǎo),靶向IKKβ小干擾RNA可以有效抑制恒河猴術(shù)后濾過(guò)區(qū)的疤痕化,具有良好的生物相容性,并且不會(huì)導(dǎo)致MMC類