葡聚糖—阿霉素—聚乙烯亞胺納米載體介導(dǎo)RNA干擾沉默Livin基因在骨肉瘤中的作用研究.pdf

1、目的：
　　骨肉瘤是臨床常見(jiàn)的原發(fā)性骨惡性腫瘤之一，約占所有骨腫瘤的20％，多見(jiàn)于青少年，惡性程度高，易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。Livin是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的人凋亡抑制蛋白家族的新成員，某些實(shí)體腫瘤組織中存在特異性的表達(dá)，能抑制多種凋亡刺激因素所誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(Placerltal growth factor，PlGF)是屬于VEGF家族的糖蛋白，在腫瘤等病理性血管生成和調(diào)控中發(fā)揮著極為重要的作用。PlGF作為調(diào)節(jié)新生血管生

2、成的相關(guān)因子在骨肉瘤中表達(dá)狀況的研究目前尚無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)的第一部分主要研究Livin及PlGF蛋白在骨肉瘤組織和正常骨組織中的表達(dá)差異以及該兩種蛋白在骨肉瘤組織中陽(yáng)性表達(dá)之間的相關(guān)性，分析兩者在骨肉瘤的臨床診斷及治療中的意義。該部分研究的另一目的是研究Livin及PlGF mRNA在骨肉瘤MG-63、Saos-2以及U2-OS細(xì)胞株中的表達(dá)差異，分析其與細(xì)胞分化成熟程度之間的關(guān)系；第二部分主要研究制備葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載

3、體，并對(duì)其生化特性、粒徑、形態(tài)等相關(guān)性質(zhì)進(jìn)行表征。研究該納米基因載體對(duì)骨肉瘤MG-63和Saos-2細(xì)胞增殖的抑制作用；第三部分研究構(gòu)建Livin-shRNA的真核表達(dá)載體，獲得Livin-shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的骨肉瘤MG-63細(xì)胞，應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)制備的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載體將阿霉素和Livin-shRNA質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入骨肉瘤MG-63和Saos-2細(xì)胞中并優(yōu)化轉(zhuǎn)染效率，研究該納米載體介導(dǎo)的化療聯(lián)合基因治療在骨肉瘤中的綜合

4、作用。為進(jìn)一步研究納米載體、基因治療以及綜合治療在骨肉瘤中的作用機(jī)制進(jìn)行探索。
　　方法：
　　第一部分：研究Livin及PlGF在骨肉瘤組織和不同骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)差異以及該兩種因子在骨肉瘤中陽(yáng)性表達(dá)的相關(guān)性，分析兩者在骨肉瘤的臨床診斷及治療中的意義；選取我院骨科在2003年至2008年之間行活檢或手術(shù)切除的57例骨肉瘤組織標(biāo)本和10例正常骨組織標(biāo)本。應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)Livin和PlGF蛋白在骨肉瘤組織和正常骨

5、組織標(biāo)本中的表達(dá)，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)弱綜合判斷兩種蛋白的表達(dá)水平，并分析兩者陽(yáng)性表達(dá)之間的相關(guān)性及與骨肉瘤各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)Livin和PlGF mRNA在骨肉瘤MG-63細(xì)胞、Saos-2細(xì)胞及U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)，研究其在不同細(xì)胞株中的表達(dá)差異。
　　第二部分：制備葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載體并對(duì)其進(jìn)行表征。通過(guò)兩步法合成葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載體，

6、優(yōu)化制備條件。首先，由于高碘酸鈉引發(fā)的氧化反應(yīng)，葡聚糖T40被氧化產(chǎn)生醛基。鹽酸羥胺滴定法測(cè)定氧化葡聚糖的氧化程度和醛基含量，紅外光譜及紫外光譜分析對(duì)氧化葡聚糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，水相凝膠滲透色譜儀測(cè)定氧化葡聚糖的分子量。其次，阿霉素及聚乙烯亞胺分子中的游離氨基通過(guò)雪夫式堿(Skiff base)的形式結(jié)合到氧化葡聚糖的醛基上，應(yīng)用硼氫化鈉促使該反應(yīng)產(chǎn)物形成穩(wěn)定的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因載體。采用紫外分光光度法測(cè)定該納米基因載體中

7、偶合阿霉素的含量和載藥率。應(yīng)用紫外光譜、紅外光譜以及核磁共振分析對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，應(yīng)用透射電鏡觀察該納米載體的形態(tài)及大小，應(yīng)用馬爾文激光粒度儀測(cè)定納米載體的粒徑和表面電位。利用該納米載體上的氨基與DNA的磷酸根基團(tuán)通過(guò)靜電吸附作用形成穩(wěn)定的納米基因復(fù)合物，應(yīng)用透射電鏡觀察其形態(tài)和大小，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)該納米基因載體對(duì)DNA的縮合能力，激光粒度儀測(cè)定其粒徑和表面電位。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定阿霉素、葡聚糖-聚乙烯亞胺共聚物以及葡聚

8、糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體對(duì)骨肉瘤MG-63和Saos-2細(xì)胞的增殖抑制作用。
　　第三部分：研究葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體介導(dǎo)的化療聯(lián)合基因治療在骨肉瘤中的綜合作用。合成Livin基因干擾序列并定向插入到RNA干擾(RNAi)真核表達(dá)載體pGenesil-1質(zhì)粒，通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。干擾質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG-63細(xì)胞，經(jīng)G-418持續(xù)篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Livin shRNA的細(xì)

9、胞系。Real-timePCR和Western blot分別檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中Livin mRNA和蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證Livin-shRNA真核表達(dá)質(zhì)粒在骨肉瘤MG-63細(xì)胞中對(duì)Livin的基因沉默效果。應(yīng)用上述實(shí)驗(yàn)制備的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因?qū)ivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)入骨肉瘤MG-63和Saos-2細(xì)胞中并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件(以攜帶相同Livin shRNA質(zhì)粒的脂質(zhì)體載體以及PEI25K載體為陽(yáng)性對(duì)照)。倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)

10、染前后骨肉瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變以及轉(zhuǎn)染后綠色熒光蛋白的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定該納米載體對(duì)Livin shRNA表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，并分析其與脂質(zhì)體Lipofectamine2000以及PEI25K的轉(zhuǎn)染效率之間的差異。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該納米載體介導(dǎo)的阿霉素和Livin基因的下調(diào)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的聯(lián)合抑制作用。
　　結(jié)果：
　　第一部分：Livin及PlGF表達(dá)主要定位于骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞核，為棕黃色顆粒。57

11、例骨肉瘤組織中Livin及PlGF陽(yáng)性表達(dá)數(shù)為分別為30例(52.6％)和37例(64.9％)，該兩種蛋白在10例正常骨組織中均無(wú)陽(yáng)性表達(dá)。兩者在骨肉瘤組織中的表達(dá)顯著高于正常骨組織(P<0.05)。Livin與PlGF mRNA在三種骨肉瘤(MG-63、Saos-2、U2-OS)細(xì)胞中均呈現(xiàn)表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果顯示Livin基因在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于在Saos-2和U2-OS細(xì)胞中的表達(dá)，分別是后者的1.59

12、和2.39倍。PlGF mRNA在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)分別是U2-OS細(xì)胞的8.57倍和Saos-2細(xì)胞的3.49倍。Livin及PlGF的陽(yáng)性表達(dá)在不同年齡、性別、腫瘤部位及病理學(xué)分型分組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在不同骨肉瘤Enneking臨床分期、腫瘤大小分組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在腫瘤直徑≤5cm的38例標(biāo)本中，Livin的陽(yáng)性表達(dá)率為42.1％，>5cm的19例標(biāo)本中為73.7％，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0

13、02)。而PlGF在腫瘤≤5cm與>5cm的兩組之間的陽(yáng)性表達(dá)率分別為52.6％和89.5％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=-0.013)。PlGF在Ⅰ B～ⅡA期骨肉瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率僅為40.0％，ⅡB～Ⅲ期為78.4％，兩組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。Ⅰ B～ⅡA期骨肉瘤中，Livin的陽(yáng)性表達(dá)率為30％，但在ⅡB～Ⅲ期中為64.9％，兩組之間的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。30例Livin蛋白表達(dá)陽(yáng)性的骨肉瘤組

14、織，PlGF蛋白表達(dá)陽(yáng)性者為22例，在Livin陰性表達(dá)的26例標(biāo)本中PlGF有6例陰性表達(dá)。在骨肉瘤中，Livin的陽(yáng)性表達(dá)與PlGF的陽(yáng)性表達(dá)之間不具有相關(guān)性(P=-0.642)。
　　第二部分：紫外光譜及紅外光譜表征結(jié)果表明氧化葡聚糖分子中出現(xiàn)了葡聚糖分子本身不具有的醛基結(jié)構(gòu)。鹽酸羥胺滴定實(shí)驗(yàn)表明氧化葡聚糖的醛基含量與投入反應(yīng)的高碘酸鈉的質(zhì)量成正比，水相凝膠滲透色譜分析結(jié)果表明隨著氧化程度的增加，氧化葡聚糖的分子量相應(yīng)減少。

15、當(dāng)投入反應(yīng)的高碘酸鈉與葡聚糖質(zhì)量比為2時(shí)，所形成的氧化葡聚糖的醛基含量是15.8 mmol/L，而此時(shí)其分子量由40000減少到13000左右。葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體分別在490 nm處出現(xiàn)阿霉素的特征性紫外吸收峰以及在核磁共振圖譜的3.9-4.0 ppm和2.5-3.2 ppm處分別出現(xiàn)了阿霉素和聚乙烯亞胺的特征峰。激光粒度儀測(cè)定該納米載體的粒徑和Zeta電位分別為225±47 nm和+33.84±4.1 mV。上述表征結(jié)

16、果均表明阿霉素和聚乙烯亞胺已被成功偶合到氧化葡聚糖分子上。紫外分光光度法測(cè)定該納米載體中阿霉素的偶合率為17.43±0.548％，并且在雙蒸水溶液中較穩(wěn)定，以雙蒸水為介質(zhì)透析4天后游離阿霉素的濃度由0.0107±0.005 mg/L減少至0.0023±0.005 mg/L。透射電鏡結(jié)果顯示該納米粒為近似圓形，分散性較好。納米載體與DNA以不同的N/P比混合后所形成復(fù)合物的粒徑隨N/P比的增加呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)，Zeta電位卻呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)。

17、當(dāng)N/P為4時(shí)，納米基因復(fù)合物的粒徑減少到166±22 nm，Zeta電位則為+14.47±4.1 mV。而N/P進(jìn)一步增大到20，納米基因復(fù)合物的粒徑也隨之減小到146±23 nm，此時(shí)的Zeta電位則增加到為+24.71±5.3 mV。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明給藥24小時(shí)后，阿霉素對(duì)MG-63和Saos-2細(xì)胞的增殖抑制作用均低于同濃度的葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體，但兩組之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而給藥48小

18、時(shí)后納米載體的細(xì)胞抑制作用則明顯高于游離阿霉素(P<0.05)。而單純葡聚糖-聚乙烯亞胺共聚物在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)兩種骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制作用明顯低于游離阿霉素和葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　第三部分：測(cè)序結(jié)果表明，所獲得的重組干擾質(zhì)粒目的片段與預(yù)期完全相符，表明退火形成的干擾寡核苷酸成功連接入pGenesil-1載體。干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下呈明亮綠色熒光，表明細(xì)胞

19、中有轉(zhuǎn)染的外源基因表達(dá)。Real-time PCR結(jié)果表明Livin shRNh質(zhì)粒有抑制MG-63細(xì)胞中Livin基因表達(dá)的作用，干擾作用達(dá)72％；轉(zhuǎn)染Livin shRNA質(zhì)粒后的細(xì)胞中Livin基因表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組、非特異性轉(zhuǎn)染組，(P<0.05)。而空白對(duì)照組、非特異性轉(zhuǎn)染組相比，Livin基因表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。轉(zhuǎn)染后Livin蛋白顯色可見(jiàn)，特異性L(fǎng)ivin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的Livin蛋白

20、染色條帶減弱，Livin shRNA有抑制Livin蛋白表達(dá)的作用，干擾作用達(dá)69％。特異性轉(zhuǎn)染Livin shRNh組的Livin蛋白表達(dá)水平明顯低于空白對(duì)照組、非特異性轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。而空白對(duì)照組、非特異性轉(zhuǎn)染組相比，Livin蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Westem blot結(jié)果與Real-time PCR結(jié)果一致。倒置熒光顯微鏡以及流式細(xì)胞術(shù)均表明葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體能有效地將Livin

21、shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入骨肉瘤細(xì)胞中，其在MG-63和Saos-2細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率分別是18.6±0.40％和15.3±0.50％。轉(zhuǎn)染效率與PEI25K相似但稍低于Lipofectamine2000的轉(zhuǎn)染效率。MTT細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染早期，納米載體介導(dǎo)的Livin shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染邯可霉素對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制作用與游離阿霉素組及納米基因載體組相似，但給藥72小時(shí)后納米載體介導(dǎo)Livin shRNh質(zhì)粒轉(zhuǎn)染邯可霉素組的骨肉瘤細(xì)

22、胞存活率明顯低于游離阿霉素組和納米基因載體組(P<0.05)。其中納米基因載體組對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制作用又明顯高于游離阿霉素組(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　第一部分：本研究首次應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)PlGF在骨肉瘤組織和正常骨組織中的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用Real-time PCR方法分別檢測(cè)Livin和PlGF在三種不同骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)，分析Livin和PlGF的陽(yáng)性表達(dá)與骨肉瘤患者的臨床特征以及不同骨肉瘤細(xì)胞株的分

23、化成熟程度之間的相關(guān)性，同時(shí)研究骨肉瘤組織中PlGF與Livin陽(yáng)性表達(dá)之間的相關(guān)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Livin和PlGF均在骨肉瘤組織以及三種骨肉瘤細(xì)胞株(MG-63、Saos-2以及U2-OS)中呈現(xiàn)高表達(dá)，Livin和PlGF在不同骨肉瘤細(xì)胞株中的表達(dá)差異可能與細(xì)胞的分化成熟程度相關(guān)。Livin和PlGF蛋白在骨肉瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)之間不具有相關(guān)性。Livin及PlGF陽(yáng)性表達(dá)與骨肉瘤患者年齡、性別、發(fā)病部位以及病理分型之間均不具有相

24、關(guān)性，與骨肉瘤的腫瘤大小、腫瘤Enneking臨床分期具有明顯相關(guān)性，有可能與骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。但兩者是否可單獨(dú)或同時(shí)作為骨肉瘤患者預(yù)后的判斷指標(biāo)需要進(jìn)一步驗(yàn)證。隨著研究的不斷深入，Livin及PlGF可望成為骨肉瘤的基因治療、免疫治療的新靶點(diǎn)。
　　第二部分：本研究中應(yīng)用高碘酸鈉引發(fā)的氧化反應(yīng)，葡聚糖T40被氧化產(chǎn)生醛基，氧化葡聚糖可通過(guò)其分子中的醛基與阿霉素及聚乙烯亞胺分子中的游離氨基反應(yīng)，以雪夫氏堿的形式將三者偶合成穩(wěn)

25、定的納米基因載體。該偶合阿霉素的納米載體能有效地縮合DNA從而以靜電吸附的方式形成葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米基因復(fù)合物，該納米基因復(fù)合物由于具有較小的粒徑和陽(yáng)性表面電荷，可通過(guò)其EPR效應(yīng)選擇性靶向腫瘤組織。通過(guò)其表面正電荷與腫瘤細(xì)胞結(jié)合而被細(xì)胞內(nèi)吞，有效地將其攜帶的阿霉素以及目的基因材料同時(shí)轉(zhuǎn)入骨肉瘤細(xì)胞中。
　　第三部分：本研究構(gòu)建了Livin shRNA真核表達(dá)載體并經(jīng)基因測(cè)序驗(yàn)證了其準(zhǔn)確性，該表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染入骨肉瘤MG

26、-63細(xì)胞后可有效地下調(diào)細(xì)胞中Livin的mRNA和蛋白的表達(dá)。Livin shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MG-63細(xì)胞的建立為今后進(jìn)一步繼續(xù)研究Livin在骨肉瘤細(xì)胞中的作用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。葡聚糖-阿霉素-聚乙烯亞胺納米載體能將有效地阿霉素和Livin shRNA質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入骨肉瘤細(xì)胞(MG-63和Saos-2)中。由于葡聚糖酶對(duì)納米載體中葡聚糖的降解作用，偶合在該納米載體上的阿霉素被釋放并發(fā)揮對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)染的L

27、ivin shRNA質(zhì)粒通過(guò)RNA干擾的方式下調(diào)凋亡抑制蛋白Livin的表達(dá)，促使骨肉瘤細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性增加，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。該納米載體合成所用的葡聚糖具有良好的生物相容性和生物可降解性，氧化后依然保存著其良好的特性。隨著納米載體在體內(nèi)的降解，低分子量PEI釋放后可被排泄，其細(xì)胞毒性明顯小于無(wú)排泄途徑的高分子量PEI。低分子量PEI與氧化葡聚糖交聯(lián)后其轉(zhuǎn)染效率大大提高，與PEI25K的轉(zhuǎn)染效率相近。由于腫瘤血管通透性