聚乙二醇-聚乙烯亞胺納米載體介導骨髓間質(zhì)干細胞基因轉染的實驗研究.pdf

1、腦血管疾病嚴重威脅人類健康，干細胞移植治療和基因治療是新興的治療策略和研究熱點。對干細胞進行體外基因修飾的核心問題即選擇合適的基因載體，盡量滿足轉染效率高，制備程序簡便，免疫原性和毒性低，易于配體修飾等要求。病毒載體雖然轉染效率較高而得以廣泛應用，但構建載體及轉染程序復雜，免疫原性大，靶向性差，使其臨床應用受到極大限制。納米級非病毒基因載體陽離子多聚物聚乙烯亞胺(Polyethylenimine，PEI)的研究為基因治療指明了新的發(fā)展方

2、向。
　　 目的：
　　 制備聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物(Polyethylene glycol grafted polyethylenimine，PEG-PEI)并檢測其與骨髓間質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)的生物相容性。檢測PEG-PEI體外包裹質(zhì)粒的性能及其介導質(zhì)粒轉染MSCs的轉染效率，從而優(yōu)化可用于轉染實驗的N/P值范圍及最佳轉染效率所需的最適N/P值。
　　 方法：

3、
　　 PEG-PEI的制備由中山大學化學與化學工程學院完成。利用MTT比色法檢測PEG-PEI的細胞毒性，利用劃痕實驗(Wound Healing)和干細胞誘導分化實驗檢測PEG-PEI對MSCs生物學特性的影響。
　　 利用凝膠阻滯實驗檢測PEG-PEI包裹質(zhì)粒的能力，動態(tài)光散射法(DynamicLight Scattering，DLS)測定PEG-PEI/DNA復合物粒徑，DNaseⅠ酶解實驗檢測PEG-PEI保護

4、質(zhì)粒免受酶解的能力。利用原子力顯微鏡(Atomic Force Microscope，AFM)觀察PEG-PEI/DNA復合物形態(tài)及其與MSCs表面的相互作用。設陽離子脂質(zhì)體和HEK293T細胞作為陽性對照，配制不同N/P的PEG-PEI/DNA進行轉染實驗，利用熒光顯微鏡和流式細胞儀測定轉染效率。
　　 結果：
　　 當完全培養(yǎng)基內(nèi)的PEG-PEI濃度低于14μg/ml(對應于N/P40)，且與MSCs共孵育不超過8小

5、時時，MSCs存活率為97.5％，能遷移并占據(jù)約80％劃痕面積，在誘導條件下成功分化為脂肪細胞和成骨細胞。PEG-PEI在N/P3時將質(zhì)粒完全包裹為電中性或略帶正電荷的復合物，但N/P10之后才足以保護質(zhì)粒免受DNaseⅠ的消化，并在大于N/P15時將PEG-PEI/DNA復合物粒徑壓縮至100-150 nm。
　　 PEG-PEI/DNA復合物吸附于MSCs膜表面后可能通過內(nèi)吞被攝入細胞。N/P40時PEG-PEI/DNA轉染

6、MSCs的效率為15-21％，略高于陽離子脂質(zhì)體介導的轉染效率8-15％。N/P大于40后轉染效率降至12％。
　　 結論：
　　 1.PEG-PEI具有良好的生物相容性，對MSCs的生物學特性沒有明顯影響。
　　 2.PEG-PEI能將質(zhì)粒包裹并壓縮形成電中性或略帶正電荷的納米顆粒，避免了DNaseⅠ消化，有利于質(zhì)粒吸附于細胞表面及細胞內(nèi)吞。
　　 3.PEG-PEI在最適N/P時獲得最佳轉染效率，轉染