綠色工藝制備聚乙烯亞胺衍生物在細胞支架和介導基因轉(zhuǎn)染中的研究.pdf

1、聚乙烯亞胺(polyethyleneimine, PEI)作為典型的陽離子聚合物之一，已經(jīng)廣泛應用于組織工程支架以及作為基因轉(zhuǎn)染的載體。由于PEI本身血液相容性較差，細胞毒性大等缺點嚴重制約了其進一步應用。利用化學方法對PEI分子改性是一種有效降低其細胞毒性和改善血液相容性的方法。生物材料通過靜電紡絲技術(shù)制備的具有極大比表面積的納米纖維可以很好地模擬天然細胞外基質(zhì)，為細胞的粘附、增殖及為生理功能提供良好的微環(huán)境。
　　本論文結(jié)合兩

2、性離子化合物良好的生物相容性優(yōu)勢，設計合成兩性離子化合物PEI衍生物。利用高壓靜電紡絲技術(shù)制備PEI-C/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)的低毒復合納米纖維，考察其纖維性能和細胞毒性；研究改性后的PEI(PEI-C)作為基因載體時在水溶液中與質(zhì)粒DNA(Plasmid deoxyribonucleic acid, pDNA)之間的相互作用、納米復合物的形成、載體的生物相容性、細胞毒性及基因復合物在體外的轉(zhuǎn)染等性能

3、。
　　本論文的研究內(nèi)容主要分為以下幾個方面：
　?。?）利用綠色化學的理念，基于富氨基類聚合物對二氧化碳有很強的吸附性這一特點，結(jié)合兩性離子化合物良好的生物相容性的優(yōu)勢，用二氧化碳對超支化PEI25KDa進行改性，制備出聚乙烯亞胺衍生物(PEI-C)。通過核磁（NMR）、元素含量檢測和傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀（FT-IR）對所制備的衍生物進行表征確認其結(jié)構(gòu)?？疾於趸嘉諘r間、PEI反應濃度等影響因素，結(jié)果表明：PEI濃

4、度控制在20％~40％之間；當二氧化碳在通入0.5h后，PEI中氧元素含量已達到27％。MTT細胞毒性實驗表明，與未修飾的PEI25K相比， PEI-C材料的細胞的相對存活率維持在80％左右；而PEI的細胞毒性隨其濃度增加，細胞存活率從80％左右降低到30％以下，表明PEI-C的細胞毒性顯著降低。
　　（2）采用靜電紡絲手段，將PEI-C和PVA制備成具有良好纖維形貌的含不同比例的PEI-C/PVA復合納米纖維，用戊二醛蒸汽交聯(lián)得

5、到水穩(wěn)定的納米纖維膜。掃描電子顯微鏡（SEM）、FT-IR等手段表征其纖維膜交聯(lián)前后的形貌及結(jié)構(gòu)變化。通過對紡絲液濃度、電壓、接收距離和流速等條件的優(yōu)化，得到了具有良好纖維形貌的含不同比例的PEI-C/PVA復合納米纖維支架。以雪旺細胞（schwann cell）為模型細胞來研究該材料的生物相容性。研究表明，雪旺細胞在PEI-C/PVA復合纖維支架表面分布相比未改性的PEI/PVA復合纖維基質(zhì)更為密集，細胞形態(tài)明顯較好，更利于細胞生長；

6、MTT細胞毒性實驗進一步表明，PEI-C/PVA在質(zhì)量比為35：65時，纖維支架細胞的OD值為0.47，相當于同等條件下PEI/PVA纖維支架OD值的2倍，證實改性后的復合纖維支架的細胞毒性明顯降低。
　　（3）將所制備的PEI-C材料用于介導基因轉(zhuǎn)染的研究。蛋白吸附實驗表明二氧化碳修飾后的PEI-C材料抵御蛋白質(zhì)吸附的能力增強；脫氧核糖核酸酶I的防護和釋放實驗表明，PEI-C載體材料有保護pDNA免受細胞中核酸酶降解并且可以釋放

7、pDNA。使用凝膠電泳儀考察載體與pDNA的結(jié)合能力，采用動態(tài)光散射(DLS)和Zeta電位儀考察載體與pDNA形成的復合物的粒徑和電位。MTT細胞毒性實驗表明，與未修飾的PEI載體基因復合物(pDNA/PEI)相比，PEI-C載體基因復合物(pDNA/PEI-C)的細胞毒性顯著降低；體外轉(zhuǎn)染實驗表明，PEI-C能夠有效地介導基因轉(zhuǎn)染。以Hepa1-6細胞和QBC939細胞為模型細胞，在有血清情況下，PEI-C作為載體時在Hepa1-6