不同功能肽修飾的聚乙烯亞胺衍生物作為基因載體的研究.pdf

1、基因治療的本質是用基因載體攜帶目的基因進入靶細胞，通過遺傳學或分子生物學技術以糾正或補償基因缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療各種疾病的目的?；蛑委熥鳛橐环N新的治療手段，可以治療包括癌癥、心血管疾病和遺傳性疾病等多種疾病，目前的研究主要集中于腫瘤的治療。尋找安全高效的基因載體是基因治療的關鍵之一?；蜉d體分為病毒型基因載體和非病毒型基因載體兩大類。非病毒載體通過理化方法介導基因轉移，具有無傳染性、化學結構可控、不限制載體容量及容易于大

2、量制備等特點。與病毒載體相比，它還具有低毒性、低免疫性、所攜帶的目的基因不會整合至宿主細胞基因組等優(yōu)勢。因此，非病毒載體領域近年來被廣泛研究。聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）因其“質子海綿作用”而成為研究最廣泛的一種聚陽離子非病毒基因載體。然而PEI在應用中存在三個突出問題：第一，聚合物的轉染效率與細胞毒性不一致：即高分子量PEI轉染效率高，細胞毒性大；而細胞毒性小的低分子量PEI，轉染效率低。第二，體液穩(wěn)定性與穿

3、膜能力不一致：為了增加PEI體液穩(wěn)定性而增加聚合物的親水性，會導致PEI的穿膜能力降低，從而不利于目的基因的遞送。第三，PEI的細胞靶向性差：PEI通過靜電相互作用與細胞結合，因此無法識別特定細胞，靶向性欠缺。
　　普朗尼克(Pluronic)是聚氧乙烯—聚氧丙烯—聚氧乙烯(PEO-PPO-PEO)組成的三嵌段共聚物。具有無毒、無刺激、無免疫原性、可溶于體液等優(yōu)點，是制備聚合物膠束的常用材料之一。普朗尼克內(nèi)部的PEO鏈與PPO鏈的

4、比例可調(diào)，隨著PEO鏈比例增高，該化合物疏水性越弱，反之，則疏水性越強。普朗尼克在水溶液中自發(fā)形成多分子膠束，所形成的膠束尺寸和病毒相仿，適合在體內(nèi)傳輸。
　　整合素是細胞表面受體的主要家族，是一種介導細胞和其外環(huán)境之間的跨膜受體。整合素是由α和β兩個亞單位形成的異二聚體，由它們相互組合形成的整合素有20余種。其中，整合素αvβ3高效表達在多種腫瘤細胞表面和腫瘤新生血管的內(nèi)皮細胞中，而在普通細胞中罕有表達，因此，整合素αvβ3已成

5、為抗腫瘤藥物的靶點。RGD肽是含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的短肽鏈，能以一定的親和力結合整合素αvβ3，為腫瘤治療的靶向性提供了新的策略。細胞穿膜肽可以在不損壞細胞膜的情況下穿過細胞膜進入細胞質甚至細胞核。同時，它還可以介導DNA、多胺類物質進入細胞內(nèi)。TAT（transactivator，Tat）是編碼HIV復制和基因表達所必須的反式激活蛋白，是常見的三種細胞穿膜肽之一。TAT中49-57位氨基酸殘基arg-

6、lys-lys-arg-arg-gln-arg-arg-arg（RKKRRQRRR）組成的線性序列可以完全行使細胞穿膜功能，這是TAT肽既有穿膜特性又無細胞毒性的最小片段。大分子物質通過核孔復合物在細胞漿和細胞核之間轉運是一個主動耗能的過程，直徑小于9 nm的分子或分子量小于60 kDa的蛋白質可被動彌散通過核孔復合物中間通道。非病毒載體轉染的質粒DNA，從細胞質向細胞核被動轉運時效率較低，是一個限速過程。核定位信號肽NLS富含堿基，結

7、合DNA形成的DNA-NLS復合物，在細胞質中可被轉運蛋白識別，與蛋白質結合后將DNA轉運入核。這一特點對復合物克服細胞核膜屏障、提高體內(nèi)轉染效率至關重要。擬設計三種多肽：（1）特異性親和整合素αvβ3的RGD（R4）；（2）特異性親和整合素αvβ3的RGD肽與核定位信號肽NLS連接形成的雙功能肽RGD-NLS（R11）；（3）特異性親和整合素αvβ3的RGD肽與細胞穿膜肽TAT、核定位信號肽N L S連接形成的三功能肽RGD-TAT-

8、NLS（R18）。通過與PEI衍生物的連接，考察其作為基因載體修飾物對基因轉染的貢獻。其中，多肽可通過半胱氨酸（Cys）的巰基與PEI的氨基以SMCC為交聯(lián)劑連接，因此多肽設計時應含有半胱氨酸（Cys）。
　　三種功能肽在復合物入胞過程中起著不同的作用，將這三種肽以RGD為基礎組合成三種不同的多肽，分別與聚乙烯亞胺衍生物偶聯(lián)，形成三種不同的基因載體。通過比較其理化性質和細胞轉染效果，來評價三種不同多肽在基因載體應用中的作用。

9、>　　我們對普朗尼克P123進行活化，以其交聯(lián)低分子量PEI（PEI2KDa），得到高分子量聚乙烯亞胺衍生物P123-PEI。同時分別合成三種多肽R4、R11、R18，將三種多肽分別與PEI衍生物P123-PEI連接，形成三種新型轉基因載體 P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18。同時，比較包括細胞毒性在內(nèi)的聚合物理化性質和細胞轉染結果，評價三種不同多肽在基因載體應用中的作用。
　　本文第一章主

10、要介紹了聚乙烯亞胺PEI、普朗尼克及功能肽在基因載體中的應用。包括聚乙烯亞胺的特性、普朗尼克P123作為基因載體修飾材料的優(yōu)勢以及各種功能肽在基因載體應用中的研究成果等。
　　本文第二章為三種基因載體 P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18的合成和表征。采用固相法制取功能肽，用質譜測定多肽序列，HPLC測定相對含量。三光氣和琥珀酰亞胺法活化P123后與PEI2000連接形成 P123-PEI高分

11、子量的聚合物。最后通過SMCC分別將 R4、R11、R18與P123-PEI偶聯(lián)得到最終產(chǎn)物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18，用1H-NMR表征聚合物的結構。結果表明，成功合成了功能肽R4、R11、R18，其純度都在95％以上。通過1H-NMR分析，用SMCC法成功的將R4、R11、R18分別與P123-PEI偶聯(lián)形成最終產(chǎn)物P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R

12、18。
　　本文第三章考察了三種聚合物 P123-PEI-R4、P123-PEI-R11和P123-PEI-R18的理化性質。將三種聚合物分別與DNA混合后靜置，通過靜電吸附作用形成一定質量比的復合物。通過酸堿滴定的方式考察三種復合物的緩沖能力，使用粒度—電位儀測定復合物的粒徑及Zeta電位，采用掃描電鏡觀察復合物的表面結構，通過凝膠電泳考察各復合物包裹DNA的能力及其對DNA的保護能力，最后采用MTT法考察三種聚合物的細胞毒性。

13、結果表明，三種聚合物的緩沖能力均明顯好于純水；復合物呈類球形結構，粒徑和電位適中；P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18與DNA質量比分別為3.0、0.4和2.0時可以將DNA完全包裹，此外，三種聚合物都可以保護DNA抵抗較高濃度的Dnase I及血清的解離。與高分子量PEI（PEI25 KDa）相比，P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18的細胞活性顯著提高。

14、>　　本文第四章考察了三種復合物P123-PEI-R4/DNA、P123-PEI-R11/DNA、P123-PEI-R18/DNA的細胞轉染能力。分別以綠色熒光蛋白質粒（pEGFP-N2）和蟲熒光素酶質粒（pGL3-Control）為報告基因，考察三種復合物在B16細胞中的轉染情況。分別通過熒光倒置顯微鏡和生物化學發(fā)光儀來評價綠色熒光蛋白質粒和熒光素酶報告基因質粒的表達情況。結果表明，三種復合物的轉染效率都明顯高于不連接多肽的聚合物P1

15、23-PEI。通過三種新合成的聚合物與先前課題組成功合成的基因載體P123-PEI-R13相互比較，得出聚合物P123-PEI-R11的轉染效果是最好的；修飾基因載體的多肽種類不宜過多，過多反而影響細胞轉染效率；在修飾的多肽種類適宜的情況下，核信號定位肽NLS能顯著提高入核的效率。
　　本課題合成了三種的新型的基因載體P123-PEI-R4、P123-PEI-R11、P123-PEI-R18，并通過綜合比較得出它們都具有低毒性、高