側(cè)鏈可還原降解的聚乙烯亞胺衍生物的合成和體外基因釋放.pdf

1、基因治療就是將外源基因引入受感染的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)，以糾正致病基因所產(chǎn)生的缺陷，從而達(dá)到從根本上治療疾病的目的。
　　 目前實(shí)施基因治療的主要瓶頸是缺乏安全高效的基因傳遞系統(tǒng)。盡管病毒載體具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但存在制備復(fù)雜，有安全隱患，包裝容量有限等問(wèn)題。因此，近年來(lái)人們?cè)絹?lái)越青睞于人工合成的非病毒載體。由于陽(yáng)離子聚合物作為非病毒性載體有安全性好、制備簡(jiǎn)單方便、可多次重復(fù)使用等眾多優(yōu)點(diǎn)而受到研究者們的青睞。其中，聚乙烯亞胺(

2、PEI)因其正電荷密度較高，且可通過(guò)“質(zhì)子海綿作用”逃離內(nèi)涵體，以其結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的新型陽(yáng)離子聚合物載體成為研究熱點(diǎn)。25 kDa支化PEI是迄今為止轉(zhuǎn)染效率最高的陽(yáng)離子聚合物載體之一，現(xiàn)已經(jīng)被作為新開(kāi)發(fā)的體外轉(zhuǎn)染載體的比較標(biāo)準(zhǔn)，但其跟病毒性基因載體相比轉(zhuǎn)染效率仍然較低且在體內(nèi)不可降解，細(xì)胞毒性較大。
　　 本論文研究的主要目的在于對(duì)轉(zhuǎn)染效果較好的基因載體25 kDa支化PEI進(jìn)行改性，引入在細(xì)胞內(nèi)可還原降解的二硫鍵，制備出新型可降

3、解的聚乙烯亞胺(PEI)衍生物作為基因載體，從而實(shí)現(xiàn)高效低毒的非病毒基因轉(zhuǎn)染。25 kDa支化PEI首先分別與單體Ac-Cys-tBoc及單體Mac-Cys-tBoc進(jìn)行邁克爾加成，然后脫保護(hù)形成取代度分別為14、27、34和13、19、38的PEI-Cys衍生物，并分別命名為PEI-(Cys)x(Ac)和PEI-(Cys)x(Mac)。隨后對(duì)這些聚合物進(jìn)行了一系列的性能表征。緩沖能力測(cè)試表明所有PEI-Cys衍生物的緩沖能力都比25

4、kDa支化PEI高（21.2-23.1％比15.1％）；凝膠電泳結(jié)果表明胱胺的修飾有利于聚合物更好的壓縮DNA，PEI-(Cys)x(Ac)在N/P≥5/1時(shí)可以將DNA壓縮為80-90 nm的小粒子，比聚合物25 kDa支化PEI壓縮的復(fù)合物粒徑小（100-130 nm）。與之對(duì)比，聚合物PEI-(Cys)x(Mac)壓縮DNA形成的復(fù)合物粒子則較大（100-180 nm，N/P從30/1到5/1）；凝膠電泳及動(dòng)態(tài)光散射（DLS）測(cè)試

5、表明PEI-Cys衍生物與DNA形成的復(fù)合物在10 mM二硫蘇糖醇（DTT）的溶液中可以快速地釋放出質(zhì)粒DNA；與25 kDa支化PEI相比所有的PEI-Cys衍生物都具有更低的細(xì)胞毒性（IC50:>100 mg/L versus ca.11 mg/L）；報(bào)告基因pGL3在HeLa細(xì)胞和293T細(xì)胞中的體外基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，隨著取代度（DS）的提高，PEI-Cys衍生物的轉(zhuǎn)染效率逐漸降低，而且在相似取代度的前提下聚合物PEI-(Cys)