改性基因載體-聚乙烯亞胺共聚物的研究.pdf

1、生物醫(yī)用高分子材料作為一類(lèi)新型的非病毒基因載體有著廣泛的應(yīng)用前景，具有易于制備，結(jié)構(gòu)性能可控以及使用安全性較好等方面的有利條件，近年來(lái)成為非常熱門(mén)的研究領(lǐng)域。聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)由于其獨(dú)特的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，成為目前研究最為廣泛、有效以及有著良好應(yīng)用前景的的陽(yáng)離子聚合物非病毒基因載體之一，但由于PEI本身的毒性大，所以在很大程度上限制了它在臨床應(yīng)用的可行性。本文以PEI為起點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了幾種可以做為基

2、因載體的改性PEI共聚物，主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pDC316-EGFP/IL10，為研究IL-10在大鼠神經(jīng)病理性疼痛基因治療中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 經(jīng)PCR和測(cè)序分析顯示原始質(zhì)粒pSNAV2.0-rIL10目的基因大小和核苷酸序列完全正確。用KpnI/NheI雙酶切質(zhì)粒pSNAV2.0-rIL10，回收rIL10目的基因片段(537bp)；用NheI/EcoR V雙酶切質(zhì)粒pEGFP-

3、N3，回收EGFP報(bào)告基因片段(797bp)。將目的基因和報(bào)告基因定向克隆到真核細(xì)胞表達(dá)載體pDC316中，質(zhì)粒全長(zhǎng)5247bp，Amp抗性，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)PCR、限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切及測(cè)序分析等篩選、鑒定重組質(zhì)粒pDC316-EGFP/IL10構(gòu)建正確。
　　 (2)聚乙二醇-聚乙烯亞胺/白細(xì)胞介素-10基因傳遞系統(tǒng)(PEG-PEI/IL-10)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(DRGs)的性能研究。

4、>　　 聚乙烯亞胺(PEI)在眾多細(xì)胞中比如HeLa，HepG2，293T，NIH3T3，HUVEC，PC12，hADSC等都表現(xiàn)出較好的轉(zhuǎn)染效果，但在大鼠原代培養(yǎng)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染情況尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，我們采用本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成的非病毒基因載體聚乙二醇-聚乙烯亞胺共聚物(Polyethylene glycol-Polyethylenimine，PEG-PEI)，與同時(shí)攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白報(bào)告基因(Enhanced green fl

5、uorescence protein，EGFP)及白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒DNA(pDC316-EGFP/IL-10)形成復(fù)合物，以脂質(zhì)體復(fù)合體系Lipo/pDNA為對(duì)照，通過(guò)溴化乙錠(Ethidium Bromide，EB)排斥實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)、粒徑與電位的測(cè)定及掃描電鏡等實(shí)驗(yàn)方法觀察PEG-PEI/pDNA的復(fù)合效果。并且檢測(cè)了PEG-PEI/pDNA對(duì)原代培養(yǎng)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)

6、胞(Dorsal root ganglion cells，DRGs)的毒性、轉(zhuǎn)染效果及IL-10的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果表明，PEG-PEI在N/P比(PEG-PEI所含的氮原子和質(zhì)粒DNA中磷原子的摩爾比)為5時(shí)可完全復(fù)合pDNA；隨著N/P比的增大，PEG-PEI/pDNA復(fù)合物的粒徑逐漸減小，而表面電位逐漸增大；在N/P比為15時(shí)報(bào)告基因EGFP的轉(zhuǎn)染效果和IL-10蛋白的表達(dá)情況較好，復(fù)合物的形貌呈大小均一的球形。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了PE

7、G-PEI在原代培養(yǎng)神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中是一種有效的基因轉(zhuǎn)移載體，PEG-PEI/IL-10基因傳遞系統(tǒng)對(duì)于神經(jīng)病理性疼痛的基因治療具有潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　 (3)聚乙二醇-聚賴(lài)氨酸-聚乙烯亞胺做為潛在可降解基因傳輸載體的研究。
　　 目前大多數(shù)用于基因載體的陽(yáng)離子聚合物骨架在生理環(huán)境下是不可降解的，在細(xì)胞、組織中蓄積，引起毒性反應(yīng)，因此生物可降解聚合物基因載體以其優(yōu)良的性能受到了日益廣泛的關(guān)注。根據(jù)生物可降解聚合物作為基因載

8、體的性能要求，我們通過(guò)調(diào)整組分線(xiàn)性PEI的嵌段長(zhǎng)度，合成了不同分子量組成的含有非離子PEG、陽(yáng)離子聚合物IPEI、可降解PLL組分的三元共聚物基因載體為：①mPEG45-b-PLL66-g-(IPEI15)5.4％(N％=13.10％)；②mPEG45-b-PLL66-g-(IPEI15)7.4％(N％=14.3％)；③mPEG45-b-PLL66-g-(IPEI15)9.6％(N％=15.5％)；④mPEG45-b-PLL66-g-(

9、IPEI51)8.9％(N％=21.9％)和對(duì)照聚合物mPEG45-b-PLL66。通過(guò)酸堿滴定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了聚合物基因載體的質(zhì)子緩沖能力，將聚合物分別和報(bào)告基因質(zhì)粒pEGFP、熒光素酶基因質(zhì)粒pGL3復(fù)合，通過(guò)EB排斥實(shí)驗(yàn)、凝膠阻滯電泳實(shí)驗(yàn)、粒徑與Zeta電位的測(cè)定、DNase-Ⅰ穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)等研究方法觀察了mPEG-b-PLL-g-1PEI/pDNA的復(fù)合效果，并且檢測(cè)了復(fù)合物對(duì)HepG2、U251、BHK-21和SP2/0細(xì)胞的毒性、轉(zhuǎn)染