聚乙二醇-聚乙烯亞胺-質粒pEGFP-VEGF165納米膠束的制備及基因傳遞系統(tǒng)的優(yōu)化.pdf

1、本文聚乙二醇-聚乙烯亞胺/質粒pEGFP-VEGF165納米膠束的制備及基因傳遞系統(tǒng)的優(yōu)化進行了研究，文章主要探討了以下幾方面的內容： (1)聚乙二醇．聚乙烯亞胺共聚物的合成與表征用親水的聚乙二醇對聚乙烯亞胺進行改性，制備適用于基因轉染的非病毒類載體。以異佛爾酮二異氰酸酯活化聚乙二醇，再與聚乙烯亞胺反應，兩步法合成了聚乙二醇．聚乙烯亞胺(PEG-PEI)嵌段共聚物，分別用IR、<'1>H-NMR．、GPC、DSC對共聚物進行了表

2、征。在IR譜圖上可見mPEG—NCO中異氰酸基、及PEG．：PEI中脲基的特征峰；根據(jù)。H．NMR譜圖計算表明，此聚合反應為可控反應，通過調節(jié)PEG與PEI的投料比例可控制共聚物組成及分子量；GPC曲線上共聚物為一單峰，與PEG和PEI均聚物峰位置不同，表明產物是．PEG-PEI共聚物，DSC分析也表明共聚物Tm較均聚物均有不同程度的下降，這是PEG和PEI兩種嵌段相互纏結的結果。因此證明成功合成了PEG-PEI共聚物。 (2)

3、聚合物緩沖容量的測定所有聚合物的緩沖容量用酸堿滴定的方法獲得，用0.1M鹽酸滴定標準液滴定，緩沖容量根據(jù)公式β=dc(HCl)/dpH計算。結果表明，分子量不同的PEI緩沖容量的最大值隨著分子量的增加而降低：同一分子量的PEI接枝不同量的PEG后，緩沖容量有明顯的下降，接枝PEG量越多，緩沖容量下降越大。值得注意的是，在生理pH4～7范圍內，緩沖容量未見明顯差異。 (3)聚合物細胞毒性試驗參照ISO10993和GB/T1688

4、6醫(yī)療器械生物學評價標準和要求，采用MTT法測定了不同聚合物的細胞毒性。結果顯示，PEI的細胞毒性與分子量呈現(xiàn)正相關性，高分子量PEI的細胞毒性遠大于低分子量PEI的細胞毒性。PEI 2K在高濃度30μg/mL時幾乎未表現(xiàn)出明顯毒性，而分子量最大的PEI 750K即使在較低濃度10μg/mL時已表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，PEI 10K．和PEI 25K毒性居中。接枝PEG后可明顯降低聚合物的細胞毒性，接枝PEG的量越多，PEI的細胞毒性降低

5、越顯著。 (4)真核表達質粒pEGF-VEGF165的構建采用PCR技術，從原核表達質粒PUC19-VEGF165中獲得上下游含有Hind Ⅲ和：BamH I酶切位點的目的基因VEGF165，與真核載體pEGFP-C1構建重組質粒pEGFP-vEGF165。通過酶切和測序鑒定證實，帶有綠色熒光蛋白報告基因的真核表達質粒pEGFP-VEGF165構建成功。 (5)聚合物/質粒pEGFP-VEGF165復合物的自組裝對不同分

6、子量的PEI及PEG-PEI共聚物與質粒DNA形成復合物的凝膠阻滯試驗、結合平衡試驗研究表明，PEI 2K在N/P為5時仍不能完全與DNA結合，高分子量的PEI在較低的N/P比就能對DNA起到完全阻滯作用。接枝PEG側鏈后并未明顯影響PEI與DNA的結合能力。對DNA酶的穩(wěn)定性試驗可以得出，形成復合物后可以保護DNA免受DNase I酶的降解，且聚合物與DNA完全結合的程度影響復合物對DNase I的穩(wěn)定性。 (6)聚合物/質粒

7、pEGFP-VEGF165復合物的性能研究進行了復合物的粒徑、Zeta電位、透射電鏡(TEM)和在水溶液中的溶解性的分析，結果表明，低分子量PEI與DNA形成復合物的粒徑明顯大于高分子量的：PEI，接枝了PEG后，PEG-PEI/DNA復合物的粒徑都明顯減小，接枝不同分子量的PEG對粒徑也有一定影響；Zeta電位隨PEl分子量的增大而增大，接枝分子量較大的PEG可使Zeta電位下降較多，復合物的粒徑和Zeta電位都與組成中的N/P有關。

8、接枝親水鏈段PEG對降低粒子間的聚集和增加溶解性起到了關鍵性的作用。 (7)聚合物/質粒pEGFP-VEGF165復合物的細胞轉染試驗考察了PEI及PEG-PEI共聚物在HUVEC和VSMC兩種細胞中的轉染率，結果表明，對于不同分子量的PEI在兩種細胞中的轉染率，均為PEI 2K的轉染率最低，而PEI 25K的轉染率最高。接枝少量的PEG有利于提高轉染率，而接枝較多量的PEG轉染率明顯下降。轉染率先隨著N/P比的增加而增加到一

9、定值，N/P比繼續(xù)增加，轉染率明顯下降。血清對聚合物/DNA復合物介導基因轉染有阻礙作用，而PEG化可減弱這種阻礙作用。 (8)PEG-PEI共聚物介導vEGF165基因轉染對內皮細胞增殖的影響以PEI及合成的PEG．PEI(2-25-1)共聚物，攜帶重組質粒pEGFP-VEGF165基因轉染HUVEC，探討VEGF165的表達及其對內皮細胞生長的影響。ELISA檢測證明VEGF在細胞上清中有效表達，RT-PCR證明了VEGF1

10、65 mRNA水平上的有效表達且可有效地刺激內皮細胞增殖，PEG-PEI(2-25-1)為載體比PEI 25K轉染后可更有效的促進內皮細胞增殖。 綜上所述，通過考察不同的PEl分子量、PEG分子量、PEG接枝量得到一系列PEG-PEI共聚物，與pEGFP-VEGF165形成復合物，研究了復合物的各項物理化學性能和生物學性能，可知PEI的分子量、PEG的接枝量、PEI與DNA的結合比例(N/P)對聚合物/DNA復合物的各項性能都產