基于聚乙烯亞胺為骨架的基因傳遞系統(tǒng)的制備及體內(nèi)外性能研究.pdf

1、聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)是目前研究最為廣泛的陽(yáng)離子聚合物非病毒基因載體。大分子PEI如PEI 25k具有強(qiáng)的緩沖能力，能有效壓縮DNA，在體外具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但所形成復(fù)合物不穩(wěn)定，容易聚集，毒性較大，不可降解，長(zhǎng)期使用可造成毒性積聚，所以不適合于體內(nèi)應(yīng)用。PEl分子量低于2000時(shí)不顯細(xì)胞毒性，但小分子PEI不能很好地壓縮DNA，與DNA通過(guò)靜電作用僅能成為一個(gè)很大的聚集體。轉(zhuǎn)染效率非常低，僅與裸。DN

2、A相若，所以單純的小分子PEI不能作為基因載體。 基于大分子PEI和小分子PEI應(yīng)用為基因載體時(shí)的特性，本研究設(shè)計(jì)把多個(gè)無(wú)毒性的小分子PEI 423接枝至聚乙二醇-聚谷氨酸主鏈上，改造成可降解的大分子PEI衍生物PEG-b-PLG-g-PEI。聚乙二醇嵌段可提高聚合物/DNA復(fù)合物的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)基因在血液循環(huán)中的半衰期。聚合物可被生物降解，降解位點(diǎn)聚谷氨酸的肽鍵。聚合物中聚乙二醇嵌段，聚谷氨酸嵌段和聚谷氨酸每個(gè)單體單元上的小分子

3、PEI細(xì)胞毒性均較低。由該設(shè)計(jì)思路所制得的聚合物可能成為毒性低但轉(zhuǎn)染效率高的基因載體。 冠心病病人冠脈狹窄通常使用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)(PTCA)對(duì)狹窄冠脈進(jìn)行介入性治療，但是術(shù)后發(fā)生再狹窄機(jī)率高。VEGF165基因是被公認(rèn)為可促進(jìn)內(nèi)膜修復(fù)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)從而防治PTCA術(shù)后再狹窄的基因。但是目前VEGFl65基因治療血管成形術(shù)后再狹窄的研究中所用基因載體一般為病毒載體，病毒載體存在嚴(yán)重的安全性問(wèn)題；或者是直接給予裸DNA進(jìn)

4、行治療，但這樣轉(zhuǎn)染效率低。也就是說(shuō)，暫時(shí)沒(méi)有找到適合的基因載體介導(dǎo)VEGFl65進(jìn)行血管成形術(shù)后再狹窄防治。本研究選用所合成的聚合物PEG-b-PLG-g-PEI介導(dǎo)VEGF165進(jìn)行防治血管成形術(shù)后再狹窄的基因載體，考察其體內(nèi)治療兔左側(cè)頸總動(dòng)脈血管成形術(shù)后再狹窄的療效。 本研究利用聚谷氨酸為骨架，將多個(gè)小分子PE1423鏈接成可降解的大分子PEI衍生物，并引入PEG嵌段，制得聚合物PEG-b-PLG-g-PEI。本文主要考察所

5、合成聚合物PEG-b-PLG-g-PEI的毒性和生物降解性能；PEG-b-PLG-g-PEI/DNA基因傳遞系統(tǒng)的物理化學(xué)性能及生物學(xué)性能。同時(shí)考察該傳遞系統(tǒng)的體外轉(zhuǎn)染效率及體內(nèi)防治血管成形術(shù)后再狹窄的療效。本文主要討論以下幾方面的內(nèi)容： (1)PEG-b-PLG-g-PEI的合成與表征 以ω-氨基聚乙二醇單甲醚引發(fā)聚谷氨酸芐酯羧酸酐(BLG-NCA)制得聚乙二醇．聚谷氨酸芐酯嵌段共聚物(PEG-b-PBLG)，并以小分

6、子PEI 423對(duì)PEG-b-PBLG中PBLG嵌段進(jìn)行氨解，把PEI作為側(cè)鏈接枝于聚谷氨酸主鏈上，制成以小分子PEI組成的三嵌段聚合物PEG-b-PLG-g-PEI。由1H NMR可知，聚合物PEG-b-PLG-g-PEI中PEI的分子量可由由PLG的鏈長(zhǎng)決定；IR、1H NMR、13C NMR和DSC證實(shí)聚合物含有PEG嵌段，PLG嵌段和PEI嵌段的特征峰；CD證明聚合物在有機(jī)良溶劑呈現(xiàn)α-螺旋構(gòu)象，在水溶液中為無(wú)規(guī)線(xiàn)團(tuán)構(gòu)象；GPC

7、分子量分布圖顯示為單峰，結(jié)果顯示聚合物PEG-b-PLG-g-PEI為共聚物而非混合物。 (2)聚合物PEG-b-PLG-g-PEI的生物降解性能研究 以粘度法測(cè)定聚合物PEG-b-PLG-g-PEI在水解和酶解前后分子量的變化。聚合物PEG-b-PLG-g-PEI在模擬細(xì)胞外液(PBS，pH=7.4)條件下可被水解，8天聚合物可降解20％；在模擬體內(nèi)酶環(huán)境下(木瓜蛋白酶)可被酶解，96h后聚合物降解70％。在聚乙二醇．

8、聚谷氨酸側(cè)鏈引入陽(yáng)離子PEI，與引入非離子型小分子相比，會(huì)降低聚合物的水解及酶解速度。PEG-b-PLG-g-PEI/DNA復(fù)合物在模擬細(xì)胞內(nèi)內(nèi)涵體環(huán)境(pH=5)條件下降解24 h，復(fù)合物水解24 h后DNA的檢出量與不經(jīng)水解24 h的復(fù)合物的DNA檢出量不顯顯著性差異，說(shuō)明聚合物的壓縮復(fù)合DNA的能力在24 h內(nèi)未受其生物降解性影響。 (3)聚合物PEG-b-PLG-g-PEI的毒性研究 以MTT法考察聚合物的細(xì)胞毒

9、性。由小分子PEI 423組成的聚合物PEG-b-PLG-g-PEI對(duì)Hela細(xì)胞的細(xì)胞毒性與小分子PEI 423細(xì)胞毒性接近，lmg/mL的聚合物溶液在含血清或不含血清條件下培育30 min和4 h，細(xì)胞存活率在75％以上，顯著低于大分子PEI 25k的細(xì)胞毒性。聚合物PEG-b-PLG-g-PEI的24 h和96 h的酶解產(chǎn)物均不顯細(xì)胞毒性。分別測(cè)定聚合物PEG-b-PLG-g-PEI在Hela，HepG2，Bel7402和293細(xì)

10、胞中的IC50值，顯示PEG-b-PLG-g-PEI的細(xì)胞毒性在上述四個(gè)細(xì)胞系的毒性均低于PEI 25k。利用溶血實(shí)驗(yàn)考察PEG-b-PLG-g-PEI的溶血毒性，聚合物濃度為3 mg/mL時(shí)溶血率<5％，不顯溶血毒性。 (4)PEG-b-PLG-g-PEI/DNA復(fù)合物的性能研究 以凝膠電泳實(shí)驗(yàn)考察聚合物PEG-b-PLG-g-PEI壓縮DNA的能力，GGI 40在N/P 1已可完全壓縮DNA，在N/P 2時(shí)可完全保護(hù)

11、DNA免受DNase I酶降解。DLS法測(cè)定聚合物PEG-b-PLG-g-PEI/DNA復(fù)合物粒徑范圍在150 nm附近，SEM和TEM觀察復(fù)合物粒子形態(tài)，粒子結(jié)構(gòu)形態(tài)緊密，粒徑與DLS法測(cè)定相若。復(fù)合物粒子穩(wěn)定性好，長(zhǎng)期孵育粒徑未見(jiàn)明顯增大，未見(jiàn)粒子聚集現(xiàn)象發(fā)生。復(fù)合物表面電荷15-20 mV。PEG-b-PLG-g-PEI具有較強(qiáng)的緩沖能力，pH 7.4-5.1 GGI 40氨基質(zhì)子化的百分比為20％，高于PEI 25k。PEG-b

12、-PLG-g-PEI/DNA基因傳遞系統(tǒng)的物理化學(xué)性能和生物性能顯示，它比小分子PEI 423和大分子PEI 25k更有優(yōu)勢(shì)，證明聚合物PEG-b-PLG-g-PEI可應(yīng)用為基因載體。 (5)PEG-b-PLG-g-PEI/pEGFP-C1復(fù)合物體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染研究 以流式細(xì)胞儀和熒光顯微圖片考察PEG-b-PLG-g-PEI介導(dǎo)綠色熒光蛋白pEGFP-C1體外轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。GGI 40在N/P 20時(shí)轉(zhuǎn)染效率

13、達(dá)到最大值，轉(zhuǎn)染效率接近60％，均高于常用的陽(yáng)離子基因載體PEI 25k和市售商品Lipofectamine 2000。由小分子PEI組成的GGI 40/DNA(N/P 20)在HepG2，Bel7402和293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均高于PEI 25k，分別為14％，65％，77％。血清降低PEG-b-PLG-g-PEUDNA復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率，但增加聚合物的用量可改善血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率有所降低的情況。 (6)PEG-b-PLG-g-PEI

14、介導(dǎo)pEGFP-VEGF 165基因預(yù)防和治療兔頸總動(dòng)脈血管成形術(shù)后再狹窄研究 PEG—b-PLG-g-PEI介導(dǎo)治療基因pEGFP-VEGF-165體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞，ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清，VEGF蛋白的表達(dá)量為41 ng／mL，VEGF蛋白表達(dá)水平顯著高于PEI 25k。以RT-PCR法測(cè)定經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞中含mRNA VEGF，表達(dá)水平顯著高于PEI 25k。PEG-b-PLG-g-PEI介導(dǎo)pEGFP-VEG

15、F 165轉(zhuǎn)染血管成形術(shù)后兔左側(cè)頸總動(dòng)脈，經(jīng)PEG-b-PLG-g-PEI／VEGFl65轉(zhuǎn)染后的損傷血管有mRNAVEGF表達(dá)。觀察經(jīng)．HE染色法染色的血管切片，血管內(nèi)膜增生厚度顯著低于鹽水對(duì)照組和PEI 25k基因治療組，狹窄率僅為17.2％。利用SEM觀察GGI40基因治療組血管，發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜被大量新生內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋，損傷血管內(nèi)膜修復(fù)完整。由上述可初步證明由小分子PEI組成的陽(yáng)離子聚合物PEG-b-PLG-g-PEI可介導(dǎo)pEGFP-V

16、EGF 1 65治療血管成形術(shù)后再狹窄。 綜上所述，本文根據(jù)把無(wú)細(xì)胞毒性的小分子PEI改造成生物可降解的大分子PEI衍生物的PEI改性思路，首次將小分子PEI 423接枝于聚乙二醇-聚谷氨酸主鏈上而制成的可生物降解的聚合物PEG-b-PLG-g-PEI，聚合物保留了小分子PEI的毒性特性，細(xì)胞毒性低，同時(shí)也具備大分子PEI良好的結(jié)合DNA能力和轉(zhuǎn)染能力，轉(zhuǎn)染效率較高。這為對(duì)PEI改性，改善PEI毒性，提高PEI轉(zhuǎn)染效率提供理論依