2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、相對于病毒載體來說,非病毒載體安全性更高,但轉(zhuǎn)染率低。其轉(zhuǎn)染率低的原因是非病毒載體在傳遞DNA過程中存在更多機體生理上的屏障,其中從溶酶體釋放的過程和傳遞入核的過程是影響DNA最終能否表達(dá)的關(guān)鍵步驟。
   聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)是一種陽離子聚合物,也是目前常用的非病毒載體。高分子量的PEI轉(zhuǎn)染率高但毒性較大,不適合于體內(nèi)應(yīng)用;而分子量低于2000的小分子PEI不顯細(xì)胞毒性,卻不能很好的壓縮DNA

2、,轉(zhuǎn)染效率低。為結(jié)合高分子量PEI轉(zhuǎn)染效率高和低分子量PEI毒性低的優(yōu)點,本研究設(shè)計將低分子量PEI(800Da和189Da)接枝于聚谷氨酸的主鏈上,制備可降解的PLG-g-PEIs(PLGE),以期得到毒性低、可降解且轉(zhuǎn)染率高的聚合物基因傳遞載體。
   組蛋白(Histone)是真核生物細(xì)胞核中染色質(zhì)的主要蛋白組分,富含賴氨酸和精氨酸,所帶的正電荷能與DNA結(jié)合成DNA-組蛋白復(fù)合物。在組蛋白的氨基末端還含有核定位信號(nu

3、clear location signal,NLS)功能片段,在突破核膜屏障的過程中起著重要的作用。
   氯喹是一種親溶酶體劑,可以通過提高內(nèi)涵體的pH值,誘導(dǎo)內(nèi)涵體發(fā)生膨脹而使得膜不穩(wěn)定,有助于DNA復(fù)合物從內(nèi)涵體脫離出來,避免溶酶體對DNA復(fù)合物的降解,從而提高轉(zhuǎn)染效率。
   本文制備聚谷氨酸-聚乙烯亞胺/組蛋白/氯喹多元組合作為基因傳遞系統(tǒng),以期通過系統(tǒng)的優(yōu)化,使該傳遞系統(tǒng)能突破細(xì)胞轉(zhuǎn)運的三道主要屏障:聚谷氨酸

4、-聚乙烯亞胺/組蛋白正電荷的作用于細(xì)胞膜,以內(nèi)吞形式進入細(xì)胞,突破細(xì)胞膜屏障;PEI的質(zhì)子海綿效應(yīng)和氯喹對溶酶體的作用,突破溶酶體屏障;組蛋白的核靶向作用突破核膜屏障。通過這三道屏障,最終達(dá)到低毒高效的效果。
   本文主要討論以下幾個方面的內(nèi)容:
   (1)共聚物PLGE的合成和表征。
   以PEI(189Da)引發(fā)聚谷氨酸芐酯羧酸酐(BLG-NCA)制得聚乙烯亞胺-聚谷氨酸芐酯嵌段共聚物(PEI-b-PB

5、LG),分別以小分子PEI(800Da)和PEI(189Da)對PEI-b-PBLG中PBLG嵌段進行氨解,PEI作為側(cè)鏈接枝于聚谷氨酸主鏈上,制成聚合物PLGE,通過1HNMR和GPC對共聚物進行結(jié)構(gòu)表征。
   (2)組蛋白、聚合物PLGE和氯喹的細(xì)胞毒性研究。
   以MTT法考察組蛋白、PLGE和氯喹的細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示,組蛋白在有血清存在的情況下,對Hela細(xì)胞與HUVEc細(xì)胞不顯示細(xì)胞毒性;在無血清的情況下,

6、100μg/mL的組蛋白仍顯示較小的毒性,Hela細(xì)胞和HUVEc細(xì)胞存活率均在80%以上。氯喹在濃度低于200μmol/L時對細(xì)胞毒性較低。聚合物PLGE的細(xì)胞毒性與PEI25k相比有顯著降低。
   (3)pDNA/histone/PLGE三元復(fù)合物形成的研究。
   利用圓二色光譜(CD)證明pDNA與histone、pDNA與histone/PLGE之間的相互作用。利用原子力顯微鏡(AFM)觀察pDNA和pDNA

7、/histone二元復(fù)合物以及pDNA/histone/PLGE三元復(fù)合物的表面形貌,結(jié)果顯示histone可以和DNA形成50nm左右的球形粒子,而PLGE能將pDNA/histone粒子進一步壓縮至20nm左右。
   (4)pDNA/histone/PLGE復(fù)合物的性能研究。
   以瓊脂糖凝膠電泳實驗考察histone和PLGE以及復(fù)合PLGE與histone對DNA的壓縮能力。結(jié)果表明,histone在與DNA

8、的重量比達(dá)到1∶1的時候即可與DNA緊密結(jié)合,不會有DNA條帶跑出;PLGE 800在N/P=1的時候已可完全壓縮DNA;histone與PLGE協(xié)同作用的時候,PLGE在N/P=0.8時即可完全壓縮DNA。以動態(tài)光散射法(DLS)測定pDNA/histone和pDNA/histone/PLGE在5%葡萄糖注射液中的粒徑,結(jié)果顯示pDNA/histone粒徑范圍在200nm左右,復(fù)合PLGE后粒徑有所減小,均在200m以下。以不同量hi

9、stone復(fù)合DNA后測定電位值均低于-25mV,pDNA/histone/PLGE三元復(fù)合物的電位則在15-18mV之間,復(fù)合物具有良好的穩(wěn)定性。
   (5)pDNA/histone/PLGE復(fù)合物及組合氯喹后的體外轉(zhuǎn)染研究。
   以流式細(xì)胞儀和熒光顯微圖片考察pDNA/Histone/PLGE復(fù)合物及組合氯喹后的復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示,在histone與DNA的質(zhì)量比為0.8∶1,PLGE與pDNA的N/P=

10、15時,轉(zhuǎn)染率達(dá)到最大值62.4%;histone/PLGE/氯喹多元組合基因傳遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染率相比未加氯喹的轉(zhuǎn)染率有所下降,細(xì)胞形態(tài)也有所變化,可能是由于氯喹對組蛋白和DNA之間的相互作用產(chǎn)生影響,從而削弱了組蛋白的核靶向作用,或者是復(fù)合材料增加了細(xì)胞毒性的原因。激光共聚焦圖片說明pDNA/histone/PLGE復(fù)合物突破核膜屏障的能力比Lipofectamine 2000和PEI 25k更強。
   (6)pDNA/hist

11、one/PLGE復(fù)合物在果蠅體內(nèi)的轉(zhuǎn)染研究。
   將體外細(xì)胞試驗篩選出的最佳轉(zhuǎn)染復(fù)合物pDNA/histone/PLGE 800進一步進行體內(nèi)試驗,以果蠅作為試驗對象,轉(zhuǎn)染后用imageJ圖像分析軟件獲得熒光圖片的相對熒光強度,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染復(fù)合物pDNA/histone/PLGE800的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果優(yōu)于市售轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000和陽離子聚合物PEI 25k。
   綜上所述,本文構(gòu)建聚谷氨酸-聚乙

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