半乳糖-聚乙二醇-聚-L-賴氨酸-質(zhì)粒pEGFP-C1復(fù)合物納米膠束的制備和性能研究.pdf

1、本研究設(shè)計(jì)了一種嵌段共聚物，其親水段為在人體內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生毒、副作用，無免疫源性的聚乙二醇，而疏水段則為聚-L-賴氨酸，因此利用兩組分形成的嵌段共聚物具有良好的生物相容性和生物降解性。為增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的靶向性，將半乳糖與嵌段共聚物相連制成具有受體介導(dǎo)的靶向基因給藥載體Gal-PEG-PLL，與綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-C1)能自組裝成穩(wěn)定的復(fù)合物(核/殼納米膠束)。該共聚物連有靶向性的配基一半乳糖，這種乳糖化的PEG-PLL/pEGFP-C

2、1復(fù)合物可以特異性的將pEGFP-C1投向于肝細(xì)胞，具有相對(duì)較高的基因轉(zhuǎn)染率，可生物降解性，低毒性和好的抗免疫原性。因此以綠色熒光蛋白(pEGFP-C1)為報(bào)告基因，構(gòu)建載體基因藥物治療模型，并研究該系統(tǒng)在肝細(xì)胞的靶向效果，從而尋找一種高肝靶向型的基因載體系統(tǒng)，為肝病的靶向基因治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)為今后共聚物自組裝體系，聚陽離子非病毒型基因載體、基因治療等領(lǐng)域的研究和發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。圍繞上述研究目的，本文主要探討了以下幾方

3、面的內(nèi)容。 (1)聚-L-賴氨酸的合成與表征以L-賴氨酸為原料，先制備Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸，光氣法合成Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐，并以三乙胺為引發(fā)劑，在氯仿中引發(fā)聚合，生成聚(Nε-芐氧羰基賴氨酸)，經(jīng)無水溴化氫脫芐得到聚-L-賴氨酸。其聚合度由粘度法測(cè)定，化學(xué)結(jié)構(gòu)由IR、1H-NMR證實(shí)，聚(Nε-芐氧羰基賴氨酸)和聚-L-賴氨酸分子均以α-螺旋構(gòu)型存在。由本法制備的聚-L-賴氨酸可獲很好的產(chǎn)率(＞70％)，

4、其分子量由單體/引發(fā)劑摩爾比控制。 (2)聚乙二醇單甲醚-聚-L-賴氨酸嵌段共聚物的合成及其表征以聚乙二醇單甲醚(MPEG)為原料，制備了端氨基聚乙二醇單甲醚(MPEG-NH2)，并以此為大分子引發(fā)劑，在氯仿中引發(fā)Lys(Z)-NCA開環(huán)聚合，經(jīng)無水溴化氫脫芐，合成不同組成和分子量的聚乙二醇單甲醚-聚L-賴氨酸嵌段共聚物。利用IR、1H-NMR、GPC、DSC等方法對(duì)共聚物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，MPEG-NH2引發(fā)Lys(Z

5、)-NCA開環(huán)聚合得到的是嵌段共聚物，通過1H-NMR譜計(jì)算得到了共聚物MPEG-PLL-1、MPEG-PLL-2、MPEG-PLL-3、MPEG-PLL-4中PLL鏈段的摩爾分?jǐn)?shù)分別為55.3％、79.5％、84.8％、86.1％，共聚物數(shù)均分子量(Mn)分別為2.3×104、6.1×104、8.6×104、9.5×104。 (3)半乳糖-聚乙二醇-聚-L-賴氨酸共聚物的制備與分析將聚乙二醇4000活性較弱的羥基轉(zhuǎn)化為氨基，利

6、用乳糖分子中含有半縮醛結(jié)構(gòu)，可與雙端氨基聚乙二醇(AT-PEG)分子中的伯氨基形成Schiff堿，然后在氰基硼氫化鈉作用下選擇性還原為穩(wěn)定的C-N單鍵，使半乳糖連接在PEG的一個(gè)氨基上，合成半乳糖-單端氨基聚乙二醇(Gal-PEG-NH2)，以Gal-PEG-NH2為大分子引發(fā)劑，引發(fā)Nε-芐氧羰基-L-賴氨酸-N-羧酸酐[Lys(Z)-NCA]開環(huán)聚合制備-系列半乳糖-聚乙二醇-聚-L-賴氨酸(PLL-PEG-Gal)嵌段共聚物，通過

7、調(diào)節(jié)[A]/[I]的比例可控制聚合物的分子量。利用IR、13C-NMR、UV等方法進(jìn)行共聚物結(jié)構(gòu)分析，并對(duì)其接糖率進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，乳糖與雙端氨基聚乙二醇反應(yīng)生成的帶有一側(cè)氨基的聚乙二醇能引發(fā)Lys(Z)-NCA聚合生成Gal-PEG-PLL，其中半乳糖的接入率為8.3％。隨著[A]/[I]的增加，共聚物的分子量變大。 (4)聚合物的生物降解性評(píng)價(jià)通過體外酶解試驗(yàn)，用粘度測(cè)定法研究了在胰蛋白酶作用下不同分子量的聚賴氨酸和用M

8、PEG修飾的聚賴氨酸的增比粘度ηsp的變化，結(jié)果表明，胰蛋白酶能催化降解PLL和MPEG-PLL，其降解速度與共聚物中MPEG的含量及聚合物的分子量有關(guān)；聚合物分子量越小其降解速度越快；MPEG含量越多，共聚物降解速度越快。 (5)聚合物的細(xì)胞毒性測(cè)試參照ISO10993和GB/T16886醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和要求，采用MTT法測(cè)定了不同聚合物的細(xì)胞毒性。結(jié)果是：不同分子量的PEG-PLL和Gal-PEG-PLL在高濃度(3

9、0μg/mE)時(shí)與陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)基本相同，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖均無明顯抑制作用，細(xì)胞增殖指數(shù)和增殖指數(shù)百分率與陰性對(duì)照組比較均無顯著性差異(P＞0.05)，而與陽性對(duì)照組比較具有顯著性差異(P＜0.05)，結(jié)果表明，PLL的嵌段共聚物Gal-PEG-PLL和PEG-PLL有著較好的細(xì)胞相容性，與PLL相比，細(xì)胞毒性降低。 (6)聚合物/質(zhì)粒pEGFP-C1復(fù)合物的自組裝對(duì)不同PLL及其嵌段共聚物與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物的DNA凝

10、膠滯留研究、結(jié)合平衡的研究表明，不同聚合物對(duì)質(zhì)粒DNA在N/P比大于1.5時(shí)有完全滯留作用；不同聚合物與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合物在30min后可達(dá)到飽和；進(jìn)一步的DNaseⅠ消化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合物對(duì)DNaseⅠ有一定的保護(hù)作用。 (7)聚合物/質(zhì)粒pEGFP-C1復(fù)合物的物理化學(xué)性能研究通過透射電鏡(TEM)、在水溶液中的溶解性和Zeta電位的分析，結(jié)果表明，PLL經(jīng)親水性的鏈段PEG修飾和半乳糖連接于PEG-PLL上，親水鏈段PE

11、G在降低粒子間的聚集和增加溶解性起到了關(guān)鍵性的作用。同時(shí)可知，不同聚合物/DNA復(fù)合物的粒徑和表面電荷的Zeta電位與組成中的N/P有關(guān)。 (8)聚合物/質(zhì)粒pEGFP-C1復(fù)合物的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)通過對(duì)以PLL為骨架的不同嵌段共聚物PEG-PLL，Gal-PEG-PLL轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-C1于Bel-7402細(xì)胞中，測(cè)定了多種因素對(duì)轉(zhuǎn)染率的影響，同時(shí)，不同聚合物/質(zhì)粒pEGFP-C1復(fù)合物對(duì)不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染效率試驗(yàn)，考察了

12、Gal-PEG-PLL是否具有肝靶向性。結(jié)果表明，聚賴氨酸類陽離子聚合物載體轉(zhuǎn)基因的效率主要與陽離子聚合物的組成、N/P比、血清、聚合物的分子量、復(fù)合物溶液、質(zhì)粒量有關(guān)。具有高分子量PLL轉(zhuǎn)染率高于低分子量；N/P為5時(shí)復(fù)合物的轉(zhuǎn)染率最高；血清對(duì)PLL的影響比較明顯，從以上的研究表明，PEG修飾的PLL具有一定的屏蔽作用，起到一定的保護(hù)作用，轉(zhuǎn)染率提高。當(dāng)PEG-PLL上連接靶向性配基半乳糖時(shí)，對(duì)不同部位的細(xì)胞系作用，Gal-PEG-P

13、LL在肝細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染率增加，表現(xiàn)一定的靶向性。 綜上所述，以綠色熒光蛋白(pEGFP-C1)為報(bào)告基因，構(gòu)建載體基因藥物治療模型，乳糖化的PEG-PLL/質(zhì)粒pEGFP-C1復(fù)合物可以特異性的將pEGFP-C1投向于肝細(xì)胞，具有較好的基因轉(zhuǎn)染率，可生物降解性，低毒性和好的抗免疫原性。使半乳糖-PEG-PLL/質(zhì)粒pEGFP-C1復(fù)合物達(dá)到高效，靶向和安全的目的。因此Gal-PEG-PLL為肝靶向型的基因載體系統(tǒng)，為肝病的靶向基因