慢病毒介導(dǎo)恒河猴P53和P21基因沉默的初步研究.pdf

1、腫瘤是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。作為動(dòng)物模型，非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物與人類的親緣關(guān)系最近，在遺傳學(xué)和生理學(xué)上與人類最相似。建立腫瘤的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型可以更利于腫瘤發(fā)病機(jī)理及治療方案的研究。P53基因和P21基因是十分重要的抑癌基因，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、有助于DNA修復(fù)。下調(diào)這兩個(gè)基因的表達(dá)在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。
　　目的:為了實(shí)現(xiàn)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腫瘤模型，人們期望對(duì)動(dòng)物的腫瘤相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控，降低動(dòng)物P53和P

2、21基因的表達(dá)以促進(jìn)動(dòng)物腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本文旨在應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對(duì)恒河猴P53和P21基因進(jìn)行沉默調(diào)控，以期將之應(yīng)用于恒河猴腫瘤模型的建立。
　　方法:(1)慢病毒介導(dǎo)的恒河猴P53和P21基因沉默載體的構(gòu)建及在細(xì)胞水平的驗(yàn)證:測(cè)定載體細(xì)胞COS-7中P53和P21基因的表達(dá)水平，對(duì)恒河猴P53和P21基因做生物信息學(xué)分析，優(yōu)選靶序列設(shè)計(jì)shRNA，利用慢病毒質(zhì)粒FUGW-TDT構(gòu)建shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，以R

3、eal-time PCR檢測(cè)P53和P21 mRNA表達(dá)水平，以Western blot檢測(cè)P53和P21蛋白水平表達(dá)變化。(2)恒河猴P53和P21基因沉默載體包裝及在胚胎水平的驗(yàn)證:挑選3個(gè)COS-7水平沉默效率較高的慢病毒載體進(jìn)行包裝濃縮純化，測(cè)定病毒滴度。對(duì)恒河猴進(jìn)行超數(shù)排卵2次。每次挑選10個(gè)MⅡ期卵細(xì)胞進(jìn)行單精子卵胞質(zhì)注射，其中8個(gè)進(jìn)行卵周隙慢病毒注射，每個(gè)慢病毒注射4個(gè)受精卵，另外兩個(gè)未做病毒感染，即空白對(duì)照。體外培養(yǎng)12

4、0 h，待胚胎發(fā)育至桑葚胚時(shí)觀察熒光。
　　結(jié)果:(1)慢病毒介導(dǎo)的恒河猴P53和P21基因沉默載體構(gòu)建成功并在細(xì)胞水平驗(yàn)證有效:COS-7細(xì)胞P53和P21基因表達(dá)水平較高，可以用于基因沉默效率檢測(cè);篩選到P53的3個(gè)靶位點(diǎn)，分別位于P53 mRNA的238-258 bp，681-701 bp，169-189 bp，均在開放閱讀框內(nèi)。mRNA水平沉默效率為(87.17±4.03)％，(72.62±4.11)％，(76.22±0.

5、98)％，蛋白水平沉默效率為(84.44±2.18)％，(71.04±1.18)％，(74.17±0.95)％;篩選到P21的四個(gè)靶位點(diǎn)，分別位于P21 mRNA的541-561bp、542-562bp、215-239bp、624-648bp，均在開放閱讀框內(nèi)。mRNA水平沉默效率為(91.82±3.21)％、(82.47±2.48)％、(81.31±2.69)％和(87.35±4.59)％，蛋白水平沉默效率為(88.03±0.53)％

6、、(79.78±0.42)％、(76.79±0.63)％和(85.58±0.61)％。(2)恒河猴P53和P21基因沉默載體包裝滴度達(dá)到要求并在注射胚胎后可見紅色熒光:本實(shí)驗(yàn)包裝病毒后得到滴度分別為2.51×109IU/ml，1.76×109IU/ml和1.06×109IU/ml，均大于1×109IU/ml，滿足胚胎感染的要求。在卵周隙注射慢病毒120h后，待胚胎發(fā)育到桑葚胚時(shí)均可見紅色熒光，而未注射病毒的對(duì)照組無熒光。
　　結(jié)論