慢病毒介導(dǎo)的HIF-1α基因沉默對(duì)不同p53狀態(tài)纖維肉瘤細(xì)胞放、化療乏氧抵抗的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、本課題立足于腫瘤基因與微環(huán)境的相互作用，特別是HIF-1α與p53存在著重要的交互作用，選擇同基因細(xì)胞株人纖維肉瘤細(xì)胞，p53野生型HT1080及突變型HT1080-6TG，著重探討以下兩個(gè)關(guān)鍵問題： 1．HIF-1α作為克服乏氧所致放、化療抵抗的靶點(diǎn)，其作用是否依賴于細(xì)胞不同的p53狀態(tài)?進(jìn)而為尋找適合HIF-1分子靶向治療的腫瘤患者打下理論基礎(chǔ)。 2．探討HIF-1α與p53交互作用對(duì)腫瘤放化療敏感性產(chǎn)生影響的分子機(jī)

2、制。 第一部分慢病毒介導(dǎo)的同基因細(xì)胞株HT1080與HT1080-6TG的HIF-1α基因表達(dá)沉默1材料與方法 1．1細(xì)胞株：HT1080(p53野生型)，HT1080-6TG(p53突變型)。 1．2 HIF-1α RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建：采用Invitrogen公司的BLOCK-iT Lentiviral RNAiExpression System，構(gòu)建入門克隆和病毒包裝目的質(zhì)粒。 1．3 RNA

3、干擾慢病毒的生產(chǎn)和滴度測定：四種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT的方式生產(chǎn)病毒，病毒功能滴度測定用轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)。 1.4基因穩(wěn)定沉默細(xì)胞株的篩選：慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080和HT1080-6TG細(xì)胞后用Blasticidin篩選，建立HIF-1α基因沉默細(xì)胞株。 1.5 HIF-1α mLRNA表達(dá)水平的分析：熒光定量RT-PCR。 1.6 HIF-1α蛋白表達(dá)水平的檢測： Western Blot分析。 1.7乏氧處理：三

4、氣培養(yǎng)箱調(diào)整氧濃度至0.5﹪，24h。 1.8細(xì)胞生長增殖測定：Typhan blue染色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。 2結(jié)果 2.1成功構(gòu)建HIF-1αRNAi慢病毒載體(lenti6-HIF1α)，其轉(zhuǎn)導(dǎo)HT1080與HT1080-6TG的功能低度分別為：7.43×10<'5>TU/ml和6.27×10<'5>TU/ml。 2.2成功構(gòu)建HIF-1 α基因沉默的細(xì)胞株，HT1080/HIF1α(-)與HT1080-6

5、TG/HIF1α(-)。 2.3 HT1080/HIF1α(-)與HT1080-6TG/HIF1α(-)常氧狀態(tài)下，HIF-1αmRNA水平分別下降86.7﹪和84.4﹪；乏氧狀態(tài)下分別下降91.6﹪和97.3﹪。 2.4 HT1080/HIF1α(-)與HT1080-6TG/HIF1α(-)，常氧狀態(tài)下HIF-1α蛋白質(zhì)水平較親代細(xì)胞無明顯差異，而乏氧狀態(tài)下分別下降84.7﹪和96.2﹪。 2.5 HT1080

6、、HT1080-6TG、HT1080/HIF1α(-)和HT1080-6TG/HIF1α(-)，常氧狀態(tài)下，細(xì)胞生長倍增時(shí)間分別為25.96h，26.35hrs，26.34h和24.15h。乏氧狀態(tài)下，HT1080、HT1080-6TG、HT1080/HIF1α(-)均表現(xiàn)出生長受抑，而HT1080-6TG/HIF1α(-)仍可低速生長。 3 結(jié)論 3.1采用BLOCK-iT慢病毒RNA干擾系統(tǒng)，成功構(gòu)建HIF1α si

7、RNA的慢病毒載體。 3．2應(yīng)用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)與Blasticidin篩選的方式，成功建立HIF1α基因穩(wěn)定沉默HT1080與HT1080-6TG，HIF1α無論在mRNA水平或蛋白水平均明顯下降。 3．3常氧狀態(tài)下，HIF-1α基因沉默對(duì)于細(xì)胞生長無明顯影響。 3．4乏氧狀態(tài)下，HIF-1α表達(dá)下調(diào)與p53突變同時(shí)存在時(shí)，表現(xiàn)出生長抑制抵抗。 第二部分HIF-α基因表達(dá)沉默對(duì)乏氧所致的腫瘤放、化療抵抗的影響及

8、與p53功能狀態(tài)的相關(guān)性 1材料與方法 1．1藥物敏感性實(shí)驗(yàn)：采用MTT評(píng)價(jià)對(duì)DDP和VP-16的敏感性，根據(jù)IC<,50>值計(jì)算各種細(xì)胞乏氧抵抗的OER(oxygen enhancement ratio)值。乏氧組：細(xì)胞在乏氧4h后加入藥物，然后在乏氧環(huán)境中繼續(xù)作用24h。 1．2放射敏感性實(shí)驗(yàn)：采用克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞對(duì)X射線的敏感性，劑量效應(yīng)曲線根據(jù)放射的線性平方方程(linear-quadratic eq

9、uation)擬合，并計(jì)算OER值。乏氧組：細(xì)胞在乏氧24h后，再氧合30min內(nèi)接受放療。 1．3乏氧處理：三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氧濃度至0.5﹪和1.0﹪。 2結(jié)果 2．1 HT1080和HTl080-6TG親代細(xì)胞，無論對(duì)DDP還是VP-16均表現(xiàn)出乏氧相關(guān)的藥物抵抗。 2．2乏氧所致藥物抵抗程度表現(xiàn)出氧濃度依賴性。當(dāng)氧濃度為0.5﹪時(shí)，DDP抵抗OER值，在HT1080與HTl080-6TG分別為2.47

10、±0.26和1.72±0.02；當(dāng)氧濃度為1.0﹪時(shí)，分別為1.87±0.13和1.18±011，P<0.05。 2.3乏氧所致DDP抵抗程度表現(xiàn)出p53功能狀態(tài)依賴性。當(dāng)氧濃度為0.5﹪時(shí)，DDP抵抗OER(oxygen enhancement ratio)值，HT1080為2.4±0.26，HT1080-6TG為1.7±0.02，P<0.05。 2．4乏氧所致VP-16抵抗程度無p53功能狀態(tài)依賴性。當(dāng)氧濃度為O．5

11、﹪時(shí)，VP．16抵抗OER，HT1080為2.094±0.51，HT1080-6TG為1.714±0.42，P>0.05。 2．5 HIF-1a基因沉默可克服HT1080對(duì)乏氧所致的DDP抵抗，而對(duì)VP-16抵抗無明顯作用。當(dāng)氧濃度為0.5﹪時(shí)，乏氧所致DDP抵抗的OER在HT1080/HIFlα(-)為1.4±0.33，與HT1080比較，P<0.05。 2．6 HIF-1α基因沉默對(duì)HT1080-6TG乏氧所致的DD

12、P、 VP-16抵抗均無明顯作用。 2．7 HT1080和HT1080-6TG親代細(xì)胞經(jīng)過乏氧處理后，對(duì)X射線的敏感性顯著下降，OER分別為1.24和1.23。 2．8經(jīng)過乏氧處理后，HT1080/HIFla(-)對(duì)X射線的敏感性顯著升高，OER為0.75；而HT1080-6TG/HIFla(-)仍表現(xiàn)出放療抵抗，OER為1.16。 3結(jié)論 3．1乏氧所致藥物抵抗程度表現(xiàn)出氧濃度、藥物和p53功能狀態(tài)依賴

13、性。 3．2 HIFla基因沉默逆轉(zhuǎn)乏氧誘導(dǎo)的放、化療抵抗的作用依賴于正常的p53功能狀態(tài)。 第三部分ItlF-la基因表達(dá)沉默逆轉(zhuǎn)乏氧誘導(dǎo)的放化療抵抗的機(jī)制研究 1材料與方法 1．1細(xì)胞周期分析：用流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞DNA含量，M0dtif軟件分析細(xì)胞周期。 1．2細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：采用Annexin-V/PI和Caspase 3染色流式細(xì)胞儀分析。 1．3 HIF-lα和p53下游通路蛋

14、白表達(dá)：p53、Phospho-p53(Serl5)、p21、Bid、Bax和Bcl-2采用Western blotting。 2結(jié)果 2.1乏氧24h(0.5﹪氧濃度)，HT1080和HT1080-6TG親代細(xì)胞均表現(xiàn)出周期停滯，G1期增加，S期減少。而該作用在HIF-1α基因沉默細(xì)胞均較親代細(xì)胞減弱，特別是HT1080-6TG/HIF1α(-)該作用最弱。 2.2乏氧24h(0.5﹪氧濃度)，HT1080和H

15、T1080-6TG親代細(xì)胞與HIF-1α基因沉默細(xì)胞凋亡無顯著性差異；但當(dāng)與DDP(20μM)共同作用時(shí)，4組細(xì)胞的凋亡均顯著增加。與常氧組比較，乏氧可顯著減少DDP導(dǎo)致的凋亡，該作用在HT1080、HT1080-6TG、HT1080-6TG/HIF1α(-)明顯，而HT1080/HIF1α(-)常、乏氧狀態(tài)下DDP作用后的凋亡無顯著性差異。 2.3常氧狀態(tài)下，僅Bcl-2在HIF-1α基因沉默的細(xì)胞中較親代細(xì)胞表達(dá)減少, p5

16、3、Phospho-p53(Ser15)、P21、Bid及Bax在4組細(xì)胞中無顯著性差別。乏氧狀態(tài)下，p53和Bcl-2表達(dá)較常氧組無顯著性變化；乏氧后p21表達(dá)增加可見于HT1080和HT1080-6TG親代細(xì)胞，以HT1080更顯著，而HIF-1α基因沉默細(xì)胞無表達(dá)；HIF-1α基因沉默可導(dǎo)致HT1080乏氧后Bid顯著增加，而HT1080-6TG細(xì)胞Bid僅輕度增加；乏氧后bax表達(dá)較常氧組均增加，HT1080/HIF1α(-)較

17、HT1080增加更顯著，相比較，HT1080-6TG/HIF1α(-)反而較HT1080-6TG表達(dá)減少。 3結(jié)論 3.1 HIF-1α與p53共同參與乏氧所致的細(xì)胞周期停滯作用，HIF-1α表達(dá)下調(diào)與p53失功能狀態(tài)同時(shí)存在時(shí)，細(xì)胞周期停滯作用明顯減弱。 3.2乏氧可抵抗抗腫瘤藥物引起的凋亡。HIF-1α基因沉默可克服乏氧的凋亡抵抗，而且該作用依賴于正常的p53狀態(tài)。 3.3HIF-1α與p53共同參與