2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、小干擾RNA(siRNA)能夠沉默疾病相關(guān)基因的表達(dá),但是如何有效地運(yùn)輸這些高負(fù)電荷的分子仍具有挑戰(zhàn)性。尋找和開發(fā)無(wú)毒且高效的siRNA遞送方法來實(shí)現(xiàn)特定的基因沉默一直是研究熱點(diǎn)。天然脂蛋白(低密度脂蛋白LDL和高密度脂蛋白HDL)是內(nèi)源性的納米顆粒,作為藥物載體已具有悠久的歷史,而人工模擬脂蛋白是一種新型的、具有臨床應(yīng)用潛力的納米載體。本文建立和發(fā)展了以LDL和仿HDL納米顆粒為載體的siRNA遞送方法,解決了siRNA的靶向運(yùn)輸和胞

2、漿釋放等問題,取得了以下研究結(jié)果:
  (1)使用純化的LDL納米顆粒成功地實(shí)現(xiàn)了功能性siRNA的靶向遞送。當(dāng)siRNA共價(jià)耦聯(lián)到膽固醇后,每分子的LDL上可裝載超過25分子的膽固醇-siRNA(chol-siRNA),形成的復(fù)合納米顆粒LDL-chol-siRNAs保持了LDL的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,LDL-chol-siRNAs能夠經(jīng)由LDL受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑選擇性地被細(xì)胞攝取,其基因抑制效率是單獨(dú)使用chol-s

3、iRNA的2.1倍。然而,此方法有一定的局限性,因?yàn)槭荏w介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑使得LDL-chol-siRNAs主要蓄積在內(nèi)體/溶酶體中,若能解決 siRNA的胞漿釋放問題,將有望獲得更好的基因沉默效果。
  (2)提出采用光化學(xué)內(nèi)化(PCI)法促進(jìn)LDL運(yùn)載藥物的胞漿釋放,發(fā)現(xiàn)PCI法對(duì)LDL表面裝載的藥物具有最佳的胞漿釋放效果。我們使用三種不同類型的熒光染料以模擬化療藥物,通過不同的方法分別裝載到LDL中,包括插入到磷脂單分子層外膜(

4、表面裝載),耦聯(lián)到apoB-100蛋白的特定氨基酸上(蛋白標(biāo)記法),重組進(jìn)入LDL的脂質(zhì)核心(核心裝載)。熒光顯微成像結(jié)果顯示,這些載藥的LDL納米顆粒均是通過LDL受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制進(jìn)入人肺癌細(xì)胞A549中的。當(dāng)聯(lián)合使用PCI法后,通過比較光照前后細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)變化的倍數(shù),顯示出不同裝載類型藥物的胞漿釋放程度:LDL表面裝載的染料DiI釋放量最大,脂蛋白耦聯(lián)標(biāo)記的染料FITC釋放程度次之,核心裝載的染料Fluo-BOA胞漿釋放效果不佳

5、。此結(jié)果表明, PCI法誘導(dǎo)的LDL裝載藥物的胞漿釋放,與LDL的載藥方式密切相關(guān),因而尤其適用于解決LDL表面裝載chol-siRNA的胞漿釋放問題。引入PCI法后,LDL-chol-siRNA的基因沉默效果隨著光照的時(shí)間增加而提高,到最大光照時(shí)間為180s時(shí),基因抑制效率從38%提高到78%。(3)利用HPPS(仿HDL納米載體)靶向清道夫 B類 I型受體(SRB1)的機(jī)制,建立了一種新的納米載藥方法能將siRNA直接運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞胞漿

6、中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,每分子HPPS可有效地裝載8分子的chol-si-bcl-2(膽固醇修飾的siRNA靶向bcl-2),形成的HPPS-chol-si-bcl-2納米顆粒保持了良好的結(jié)構(gòu)完整性和納米顆粒的均一性,對(duì)SRB1高表達(dá)的細(xì)胞具有明顯的Bcl-2蛋白表達(dá)抑制效果,而對(duì)SRB1低表達(dá)的細(xì)胞無(wú)此功能。通過熒光共聚焦成像和亞細(xì)胞碎片分離技術(shù)進(jìn)一步證實(shí),HPPS-chol-si-bcl-2在胞內(nèi)的攝取涉及到一種直接的胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。與單獨(dú)

7、的chol-si-bcl-2相比,HPPS-chol-si-bcl-2在Bcl-2蛋白表達(dá)的抑制和促凋亡方面分別有4.8倍和2.5倍的增加。直接的胞漿釋放機(jī)制和良好的生物相容性使得HPPS尤其適合于遞送胞內(nèi)活性的基因干擾藥物。
  (4)成功地將靶向分子表皮生長(zhǎng)因子(EGF)耦聯(lián)到HPPS上,使得HPPS的靶向性由SRB1轉(zhuǎn)換為EGF受體,拓展了HPPS在腫瘤靶向診療中的應(yīng)用范圍。建立了評(píng)價(jià)納米顆粒靶向性的雙色熒光標(biāo)記方法,雙色熒

8、光成像證實(shí)裝載有近紅外熒光染料DIR-BOA的EGF-HPPS能夠被高表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)-EGFR的細(xì)胞特異地識(shí)別與攝取,而不表達(dá)GFP-EGFR的細(xì)胞則無(wú)DiR-BOA熒光信號(hào)。
  本研究利用脂蛋白和人工模擬脂蛋白作為siRNA的遞送載體,分別采用PCI法和SRB1特異性運(yùn)輸機(jī)制等手段,有效地解決了LDL和HPPS運(yùn)載siRNA過程中的胞漿釋放問題,為加速脂蛋白納米載體成為高效的siRNA運(yùn)輸平臺(tái)提供了技術(shù)支撐,同時(shí)也

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