基于羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體的miR96內(nèi)耳遞送初步研究.pdf

1、感音神經(jīng)性耳聾是由于耳蝸毛細(xì)胞、聽神經(jīng)或聽覺中樞病變，對聲音的感受或神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)發(fā)生障礙引起的聽力下降。大部分感音神經(jīng)性耳聾是由耳蝸感覺神經(jīng)上皮毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或功能異常引起的，而哺乳動(dòng)物損傷的毛細(xì)胞不可自主再生。最根本的治療方法是通過干預(yù)促進(jìn)異常毛細(xì)胞修復(fù)或死亡毛細(xì)胞再生。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)約30424個(gè)成熟miRNA參與幾乎所有細(xì)胞的增殖、分化、生長發(fā)育過程，多種miRNA在小鼠耳蝸中高表達(dá)，其中miRNA183家族被證實(shí)

2、與耳蝸毛細(xì)胞的分化、發(fā)育及人類聽力損失密切相關(guān)。
　　RNA干擾主要是通過miRNA實(shí)現(xiàn)特定基因沉默。選擇合適的載體將miRNA遞送至內(nèi)耳是實(shí)現(xiàn)RNA干擾的關(guān)鍵。病毒載體和非病毒載體是目前常用的miRNA載體，病毒載體有誘發(fā)免疫反應(yīng)、潛在致癌等風(fēng)險(xiǎn)，使其在體應(yīng)用中受限。近年來，非病毒載體逐漸成為研究熱點(diǎn)，其中，納米載體以其無免疫原性、可生物降解性及生物相容性等優(yōu)勢，成為較理想的miRNA載體。
　　陽離子脂質(zhì)體(Lipo)由

3、于其高轉(zhuǎn)染率是目前最常用的非病毒性miRNA載體，但由于其自身帶有正電荷，細(xì)胞毒性較大，并且無靶向性和緩釋特性，因此無法實(shí)現(xiàn)應(yīng)用于臨床。羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體(CTNs)，是由羧甲基化的殼聚糖與TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽通過自組裝方式合成的納米顆粒。羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan，CMC)有良好的生物相容性及幾乎無毒性，產(chǎn)物無毒、可被生物體吸收，且可溶于水，是一種具有PH感應(yīng)性的兩性聚合材料。TAT蛋白

4、轉(zhuǎn)導(dǎo)肽是人類免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus-1，HIV-1)編碼的帶正電荷多肽，可以通過共價(jià)結(jié)合或靜電作用高效穩(wěn)定的結(jié)合核酸，其短肽有破膜作用，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的外源生物大分子通過生物膜和生理屏障，達(dá)到高轉(zhuǎn)染率。CTNs不但有高效轉(zhuǎn)染的特性，而且在酸性環(huán)境中，表面負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾桑岣邇?nèi)含體逃逸能力，達(dá)到高效轉(zhuǎn)染、靶向緩釋的目的。目前脂質(zhì)體是內(nèi)耳遞送miRNA最常用的非病毒載體，盡管CTNs已成

5、功用于miRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，并能夠?qū)崿F(xiàn)相應(yīng)的功能調(diào)控，但其用于內(nèi)耳遞送miRNA研究未見報(bào)道。
　　目的:
　　構(gòu)建用于內(nèi)耳遞送miRNA的非病毒納米載體，以陽離子脂質(zhì)體作為對照，初步探究羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽納米載體(CTNs)介導(dǎo)miR96轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜的效率及安全性，為miR96在內(nèi)耳的功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.通過Lipo與cy3標(biāo)記的miR96混合制得Lipo-miR

6、96-cy3復(fù)合物，設(shè)濃度為30nM，50nM，100nM的Lipo-miR96-cy3復(fù)合物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜，并設(shè)空白和miRNA96-cy3為對照組，激光共聚焦顯微鏡下觀察cy3紅色熒光分布情況、細(xì)胞特異性。
　　2.CMC和TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽按1.5mg/1mg(1.5∶1)質(zhì)量比制備獲得的CTNs，包封miR96-cy3制備羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽-miR96-cy3(M-CTNs)復(fù)合物。
　　3.用

7、150nM Lipo-miR96-cy3復(fù)合物和M-CTNs復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜8小時(shí)，并設(shè)空白對照組，以Lipo-miR96-cy3復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率為對照評(píng)估M-CTNs復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效果及細(xì)胞特異性，MTT測定比較兩種載體的細(xì)胞毒性。
　　結(jié)果:
　　1.Lipo-miRNA96-cy3復(fù)合物與293細(xì)胞共同作用8小時(shí)后，被成功攝取，并且隨Lipo-miRNA96-cy3復(fù)合物轉(zhuǎn)染濃度的增大，cy3紅色熒光陽

8、性細(xì)胞數(shù)增多，50nM組熒光陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于30nM組(t=-10.801，P=0.000)，100nM組熒光陽性細(xì)胞數(shù)明顯高于50nM組(t=11.754，P=0.000)，并且單個(gè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增強(qiáng),對照組未見熒光。Lipo-miRNA96-cy3復(fù)合物與耳蝸基底膜共同作用8小時(shí)后，內(nèi)外毛細(xì)胞、支持細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)均可見紅色熒光，并隨濃度增大而增強(qiáng)，無明顯細(xì)胞特異性。
　　2.本部分實(shí)驗(yàn)成功制備了CTNs，納米顆粒平均

9、直徑約186.6nm，粒徑分布集中，無明顯團(tuán)聚現(xiàn)象。M-CTNs復(fù)合物包封率達(dá)90％以上，對PH5.5的酸性環(huán)境反應(yīng)靈敏，zeta電位在1小時(shí)內(nèi)由-30.9mV快速升至20mV，具備將負(fù)電荷轉(zhuǎn)變?yōu)檎姾傻馁|(zhì)子化特性，為后續(xù)研究打下基礎(chǔ)。
　　3.Lipo-miR96-cy3復(fù)合物和M-CTNs復(fù)合物分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞和耳蝸基底膜，均表現(xiàn)為Lipo組熒光較M-CTNs組強(qiáng)，但Lipo組熒光呈聚集點(diǎn)狀分布，而M-CTNs組熒光呈均勻分