基于羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉導肽納米載體的miR96內耳遞送初步研究.pdf

1、感音神經(jīng)性耳聾是由于耳蝸毛細胞、聽神經(jīng)或聽覺中樞病變，對聲音的感受或神經(jīng)沖動的傳導發(fā)生障礙引起的聽力下降。大部分感音神經(jīng)性耳聾是由耳蝸感覺神經(jīng)上皮毛細胞的結構或功能異常引起的，而哺乳動物損傷的毛細胞不可自主再生。最根本的治療方法是通過干預促進異常毛細胞修復或死亡毛細胞再生。隨著基因技術的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)約30424個成熟miRNA參與幾乎所有細胞的增殖、分化、生長發(fā)育過程，多種miRNA在小鼠耳蝸中高表達，其中miRNA183家族被證實

2、與耳蝸毛細胞的分化、發(fā)育及人類聽力損失密切相關。
　　RNA干擾主要是通過miRNA實現(xiàn)特定基因沉默。選擇合適的載體將miRNA遞送至內耳是實現(xiàn)RNA干擾的關鍵。病毒載體和非病毒載體是目前常用的miRNA載體，病毒載體有誘發(fā)免疫反應、潛在致癌等風險，使其在體應用中受限。近年來，非病毒載體逐漸成為研究熱點，其中，納米載體以其無免疫原性、可生物降解性及生物相容性等優(yōu)勢，成為較理想的miRNA載體。
　　陽離子脂質體(Lipo)由

3、于其高轉染率是目前最常用的非病毒性miRNA載體，但由于其自身帶有正電荷，細胞毒性較大，并且無靶向性和緩釋特性，因此無法實現(xiàn)應用于臨床。羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉導肽納米載體(CTNs)，是由羧甲基化的殼聚糖與TAT蛋白轉導肽通過自組裝方式合成的納米顆粒。羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan，CMC)有良好的生物相容性及幾乎無毒性，產(chǎn)物無毒、可被生物體吸收，且可溶于水，是一種具有PH感應性的兩性聚合材料。TAT蛋白

4、轉導肽是人類免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus-1，HIV-1)編碼的帶正電荷多肽，可以通過共價結合或靜電作用高效穩(wěn)定的結合核酸，其短肽有破膜作用，能夠轉導不同的外源生物大分子通過生物膜和生理屏障，達到高轉染率。CTNs不但有高效轉染的特性，而且在酸性環(huán)境中，表面負電荷轉變?yōu)檎姾桑岣邇群w逃逸能力，達到高效轉染、靶向緩釋的目的。目前脂質體是內耳遞送miRNA最常用的非病毒載體，盡管CTNs已成

5、功用于miRNA轉染腫瘤細胞，并能夠實現(xiàn)相應的功能調控，但其用于內耳遞送miRNA研究未見報道。
　　目的:
　　構建用于內耳遞送miRNA的非病毒納米載體，以陽離子脂質體作為對照，初步探究羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉導肽納米載體(CTNs)介導miR96轉染293細胞和耳蝸基底膜的效率及安全性，為miR96在內耳的功能研究奠定基礎。
　　方法:
　　1.通過Lipo與cy3標記的miR96混合制得Lipo-miR

6、96-cy3復合物，設濃度為30nM，50nM，100nM的Lipo-miR96-cy3復合物轉染293細胞和耳蝸基底膜，并設空白和miRNA96-cy3為對照組，激光共聚焦顯微鏡下觀察cy3紅色熒光分布情況、細胞特異性。
　　2.CMC和TAT蛋白轉導肽按1.5mg/1mg(1.5∶1)質量比制備獲得的CTNs，包封miR96-cy3制備羧甲基殼聚糖-TAT蛋白轉導肽-miR96-cy3(M-CTNs)復合物。
　　3.用

7、150nM Lipo-miR96-cy3復合物和M-CTNs復合物分別轉染293細胞和耳蝸基底膜8小時，并設空白對照組，以Lipo-miR96-cy3復合物轉染效率為對照評估M-CTNs復合物的轉染效果及細胞特異性，MTT測定比較兩種載體的細胞毒性。
　　結果:
　　1.Lipo-miRNA96-cy3復合物與293細胞共同作用8小時后，被成功攝取，并且隨Lipo-miRNA96-cy3復合物轉染濃度的增大，cy3紅色熒光陽

8、性細胞數(shù)增多，50nM組熒光陽性細胞數(shù)明顯高于30nM組(t=-10.801，P=0.000)，100nM組熒光陽性細胞數(shù)明顯高于50nM組(t=11.754，P=0.000)，并且單個細胞內熒光強度增強,對照組未見熒光。Lipo-miRNA96-cy3復合物與耳蝸基底膜共同作用8小時后，內外毛細胞、支持細胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細胞內均可見紅色熒光，并隨濃度增大而增強，無明顯細胞特異性。
　　2.本部分實驗成功制備了CTNs，納米顆粒平均

9、直徑約186.6nm，粒徑分布集中，無明顯團聚現(xiàn)象。M-CTNs復合物包封率達90％以上，對PH5.5的酸性環(huán)境反應靈敏，zeta電位在1小時內由-30.9mV快速升至20mV，具備將負電荷轉變?yōu)檎姾傻馁|子化特性，為后續(xù)研究打下基礎。
　　3.Lipo-miR96-cy3復合物和M-CTNs復合物分別轉染293細胞和耳蝸基底膜，均表現(xiàn)為Lipo組熒光較M-CTNs組強，但Lipo組熒光呈聚集點狀分布，而M-CTNs組熒光呈均勻分