TAT-殼聚糖修飾多壁碳納米管藥物遞送系統(tǒng)的研究.pdf

1、納米技術(shù)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了抗癌藥物更加有效的靶向輸送，使藥物定向富集于病變組織、器官、細(xì)胞，從而更有效地殺傷腫瘤，并將對正常組織的毒性降到最小。功能化碳納米管(Functionalized Carbon Nanotubes，f-CNTs)由于其獨(dú)特的功能和特性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景，特別是功能化碳納米管可作為基因或藥物遞送的有效載體。但是，作為基因或藥物載體應(yīng)用，碳納米管在水溶液中分散性較差，并且容易發(fā)生聚集，在一定程度上限制了

2、碳納米管在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，因此其分散性及聚集現(xiàn)象的改善具有重要的研究意義。同時，在碳納米管遞送的過程中，高的細(xì)胞攝入率和良好的生物安全性至關(guān)重要。
　　本論文通過殼聚糖和TAT多肽對多壁碳納米管進(jìn)行修飾，研究新型功能化碳納米管載體。殼聚糖較好的水溶性、生物相容性及可降解性，可以通過表面吸附作用修飾于碳納米管，在大大提高碳納米管分散性的同時，既不會損傷碳納米管獨(dú)特的物理特性如光熱性能，又可以進(jìn)一步交聯(lián)特異性靶向分子，如單克隆抗體

3、、多肽及糖類等。
　　本研究通過共價修飾的方法將TAT多肽交聯(lián)于低分子量殼聚糖上(TAT-CS，TC)，并以其做為多壁碳納米管的分散劑，利用TAT多肽的強(qiáng)穿膜效應(yīng)來進(jìn)一步提高碳納米管的的分散性、生物相容性及細(xì)胞攝入，降低碳納米管的細(xì)胞毒性。同時，研究還將通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討該功能化的多壁碳納米管作為siRNA遞送載體的可行性，以進(jìn)一步拓展碳納米管在生物領(lǐng)域的應(yīng)用。具體研究分為以下三部分內(nèi)容:
　　1、TAT-CS(TC)修飾M

4、WCNTs的制備及表征
　　通過雙官能偶聯(lián)劑SPDP將TAT多肽交聯(lián)到低分子量殼聚糖分子上，通過核磁共振氫譜分析TAT-CS共聚物，結(jié)果顯示TAT在殼聚糖分子上的取代度約為4.1％。通過物理吸附作用實(shí)現(xiàn)TAT-CS(TC)對多壁碳納米管的分散，顯示當(dāng)碳納米管與TC或者CS的質(zhì)量比≥10∶1時，碳納米管可以充分的均勻分散于TC溶液或是CS溶液中。透射電鏡觀察修飾后的MWCNTs分散性更好，而形貌上無顯著性改變。通過紅外光譜及拉曼光譜

5、檢測確認(rèn)TC對MWCNTs的修飾，TGA分析CS和TC在MWCNTs-CS和MWCNTs-TC產(chǎn)物質(zhì)量中分別占有58.54 Wt.％ and59.79 wt.％。Zeta電位分析MWCNTs-TC和MWCNTs-CS的平均zeta電位為47.7±1.96和46.1±1.83，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未修飾MWCNTs(13±1.32)，說明殼聚糖所帶的正電荷大大提高了碳納米管的zeta電位值，這不僅使得碳納米管溶液可以更加穩(wěn)定，而且增強(qiáng)的正電荷也更利于

6、細(xì)胞對碳納米管的攝入。
　　2、MWCNTs-TC作為siRNA遞送載體的體外細(xì)胞學(xué)研究
　　MWCNTs-TC和MWCNTs-CS與不同的細(xì)胞相互作用后，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到兩者都能夠進(jìn)入細(xì)胞，且主要分布于胞漿內(nèi)。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀分析，細(xì)胞對MWCNTs-TC的攝入要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于MWCNTs-CS，平均熒光強(qiáng)度約為MWCNTs-CS的25倍，說明TAT的修飾使細(xì)胞對碳納米管的攝入大大提高。同時，我們的研究證實(shí)MWCN

7、Ts-TC可以更加有效的的攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MWCNTs-TC細(xì)胞毒性要小于MWCNTs-CS和MWCNTs。另外，我們還就MWCNTs的免疫毒性進(jìn)行了初步探討，通過MWCNTs與巨噬細(xì)胞的相互作用發(fā)現(xiàn)，碳納米管本身對巨噬細(xì)胞的毒性呈劑量依賴性，但并沒有引起其分泌IL-1β，IL-10，IL-12和TNF-α四種細(xì)胞因子量的改變。通過巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)的分析，發(fā)現(xiàn)多壁碳納米管引起巨噬細(xì)胞吞噬活性的增強(qiáng)。

8、而細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測顯示，碳納米管濃度較大時，細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加，說明多壁碳納米管可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　3、MWCNTs-TC的體內(nèi)分布
　　將熒光標(biāo)記的MWCNTs-TC通過尾靜脈給藥注入小鼠體內(nèi)，觀察在注射后24、48及72h其在各組織器官及腫瘤的聚集情況?；铙w成像結(jié)果顯示，尾靜脈注射后24h，MWCNTs-TC組裸鼠在腎臟和腫瘤組織中觀察到強(qiáng)烈的熒光信號，雖然隨著時間的延長，組織內(nèi)熒光強(qiáng)度在不斷減弱

9、，但在注射后48和72h，仍能在腎臟和腫瘤組織內(nèi)看見熒光。MWCNTs-CS組，只有24和48h后，在腎組織內(nèi)觀察到熒光。器官及腫瘤成像結(jié)果顯示，注射24和48h，MWCNTs-TC組的肝、肺及腫瘤組織中熒光強(qiáng)度較MWCNTs-CS組要強(qiáng)，而在心臟和脾臟中并沒有觀察到熒光。兩組中腎臟內(nèi)熒光強(qiáng)度都很強(qiáng)，提示碳納米管也是主要通過泌尿系統(tǒng)排出體外。72h，MWCNTs-TC和MWCNTs-TC組中都是只有腎臟有較強(qiáng)的熒光信號，兩組肝臟和腫瘤組

10、織內(nèi)熒光強(qiáng)度沒有顯著差別。研究分析，通過TAT的穿膜作用，使碳納米管通過被動靶向效應(yīng)大量聚集于腫瘤組織。但以MWCNTs-TC負(fù)載siRNA進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，觀察到碳納米管對熒光標(biāo)記的siRNA熒光淬滅作用很強(qiáng)，所以并沒有在體內(nèi)看到任何熒光信號。
　　綜上所述，利用具有強(qiáng)穿膜效應(yīng)的TAT多肽對低分子量殼聚糖進(jìn)行修飾后，將其作為多壁碳納米管的分散劑，可以顯著提高碳納米管的分散性及細(xì)胞攝入率，降低碳納米管的細(xì)胞毒性。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該功能化的