羧甲基殼聚糖促進(jìn)口服藥物腸道吸收機(jī)制的初步研究.pdf

1、許多具有特異療效的生物大分子藥物采用口服給藥難以通過(guò)腸道吸收進(jìn)入血液循環(huán)，極大地限制了其應(yīng)用。殼聚糖(Chitosan，CS)作為口服藥物載體具有打開(kāi)上皮細(xì)胞緊密連接(TJ)增強(qiáng)藥物細(xì)胞旁路運(yùn)輸?shù)哪芰?，殼聚?羧甲基殼聚糖(CS/CMCS)納米載體能夠更有效地促進(jìn)口服藥物透腸吸收，提高口服生物利用度，但CMCS結(jié)構(gòu)與腸道細(xì)胞作用的分子機(jī)制尚不明確。本文通過(guò)制備具有不同取代度的CMCS材料體系，以Caco-2細(xì)胞構(gòu)建腸道吸收模型，研究了C

2、MCS不同分子結(jié)構(gòu)與其作為載體材料促進(jìn)口服藥物透腸吸收之間的關(guān)系。
　　利用殼聚糖(CS)與氯乙酸反應(yīng)技術(shù)，通過(guò)控制反應(yīng)時(shí)間，成功合成了三種羧甲基殼聚糖(CMCS)樣品，分別命名為CMCS1、CMCS2和CMCS3。在中性條件下，CMCS2和CMCS3比CMCS1表現(xiàn)出更好的水溶性;三種CMCS樣品紅外光譜圖證實(shí)羧甲基基團(tuán)（-CH2COOH）成功地連接到了CS的分子骨架上，羧基特征峰面積的差異反映出羧基含量的不同;CS原料的分子量

3、為397.SkDa，CMCS1、CMCS2、CMCS3的分子量分別為449.1kDa、540.7kDa和605.1kDa，羧甲基取代度分別為36％、100％、145％，產(chǎn)物的分子量和取代度隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。CMCS1和CMCS2的羧甲基取代主要發(fā)生在C6位的-OH上，產(chǎn)物以O(shè)-CMCS為主。CMCS3的羧甲基取代在C6位的-OH達(dá)到飽和后繼續(xù)發(fā)生在C2位的-NH2上，生成產(chǎn)物主要為N，O-CMCS;三種CMCS樣品中由于引入了羧基

4、基團(tuán)（-COO-），其Ca2+螯合能力均顯著高于CS原材料，且隨著羧甲基基團(tuán)取代度的增加，Ca2+螯合能力逐漸增強(qiáng)。
　　通過(guò)MTT法評(píng)價(jià)了CS原料和三種取代度CMCS樣品的細(xì)胞毒性，72h實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，浸提液濃度在0.0625mg/mL-1mg/mL范圍內(nèi)，各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞相對(duì)增殖率均超過(guò)100％，四種材料對(duì)HUVEC、MEF和Caco-2細(xì)胞均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性。并且，CS、CMCS1、CMCS2和CMC3對(duì)HUVEC和ME

5、F的生長(zhǎng)都有明顯的促進(jìn)作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，促生長(zhǎng)作用隨著材料浸提液濃度的提高而增強(qiáng)。
　　TEER分析結(jié)果表明，0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL濃度的CS和三種CMCS樣品浸提液處理Caco-2細(xì)胞致密單層后，細(xì)胞單層TEER值在1h內(nèi)表現(xiàn)為先迅速下降后逐漸上升。TEER值降低速度隨材料濃度的增加而增大，TEER值最大降幅隨CMCS羧甲基取代度的增大而增大。全部實(shí)驗(yàn)組對(duì)Caco-2細(xì)胞致密單層作用過(guò)程均

6、表現(xiàn)出可逆性。其中，0.5 mg/ml和1 mg/ml CMCS3具有明顯較強(qiáng)的打開(kāi)細(xì)胞TJ的能力。
　　緊密連接蛋白Claudin-4免疫熒光研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/ml的CS和CMCS3作用前，細(xì)胞膜上存在大量Claudin-4蛋白，細(xì)胞間的TJ處于完整狀態(tài);作用15min后，熒光信號(hào)明顯減弱，Claudin-4蛋白急劇減少，細(xì)胞間TJ被打開(kāi);作用30 min和60 min后，熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，Claudin-4蛋白量持續(xù)增加

7、，細(xì)胞間TJ逐漸恢復(fù)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果與TEER分析結(jié)果一致，均證實(shí)CMCS3能夠有效打開(kāi)Caco-2細(xì)胞之間的TJ結(jié)構(gòu)，從而增加細(xì)胞旁通路的滲透性。
　　研究發(fā)現(xiàn)，高取代度的CMCS表現(xiàn)出更強(qiáng)的打開(kāi)細(xì)胞TJ的能力。一方面依賴(lài)于其介導(dǎo)的跨膜蛋白Claudin-4在細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移和重新分布，另一方面通過(guò)其更強(qiáng)的Ca2+螯合能力使鈣粘素因Ca2+流失而失活，破壞細(xì)胞粘附連接(AJ)結(jié)構(gòu)進(jìn)而打開(kāi)細(xì)胞TJ。該研究結(jié)果為對(duì)羧甲基殼聚糖載體材