基于殼聚糖的納米凝膠口服藥物輸送載體的構建及其透粘膜機理的研究.pdf

1、化學治療是抑制惡性腫瘤最常用也是最有效的治療方式。目前,大多數(shù)用于化學治療的抗癌藥物一般采用靜脈滴注的給藥方式。靜脈滴注的給藥方式雖然直接有效,但同時也具有耗時長,副作用大,無法連續(xù)治療的缺點?？诜拱┧幬锵鄬κ┧幏奖?耗時短,病患依從度高,但胃腸道和肝臟的首過效應使得口服化學療法難以實現(xiàn)。殼聚糖(Chitosan, CS)作為一種天然的陽離子多糖,具有良好的生物相容性和組織親和性,它能夠可逆性的打開小腸上皮細胞間緊密連接,使藥物通過細

2、胞旁途徑進入人體循環(huán),在口服藥物輸送領域具有較好的應用前景。
　　對 CS進行羧甲基化修飾,制備出中性條件下可溶的羧甲基殼聚糖(Carboxymethyl chitosan, CMCS),紅外光譜檢測證實了羧甲基基團成功連接在殼聚糖分子骨架上,烏氏粘度法測定CMCS的分子量為12 kDa,元素分析結果表明CMCS的脫乙酰度和羧甲基取代度分別為81％和92%。分別以3H-吲哚菁型生物熒光標示染料(Cy3 NHS Ester)和異硫氰

3、酸熒光素(FITC)為熒光標記,共價連接在CS和CMCS主鏈上(Cy3-CS,FITC-CMCS),用于對載體材料定位示蹤。
　　以離子交聯(lián)法制備CS納米凝膠(CS-nanogels,CS-NGs),平均粒徑和zeta電位分別為187.8 nm和+33.4 mV,以聚電解質凝聚法合成了CS/CMCS納米凝膠(CS/CMCS-nanogels, CS/CMCS-NGs),平均粒徑和zeta電位分別為202.4 nm和-40.7 mV

4、。透射電鏡觀察 CS-NGs和 CS/CMCS-NGs均為球形,其中CS/CMCS-NGs形狀規(guī)則,粒徑大小均一,分散均勻,而離子交聯(lián)法制得的CS-NGs為不規(guī)則球形,粒徑分布較寬,并有團聚現(xiàn)象出現(xiàn)。溶血實驗表明,CS-NGs和CS/CMCS-NGs的紅細胞溶血率均低于5%,符合醫(yī)用材料對于溶血率的要求。蛋白吸附實驗表明,CS-NGs和 CS/CMCS-NGs對牛血清蛋白(Bovine serum albumin, BSA)的非特異性吸

5、附率較低,結合溶血實驗結果表明兩種納米凝膠有較好的血液相容性。采用MTT法檢測了CS-NGs和CS/CMCS-NGs的細胞毒性,結果表明兩種納米凝膠對胎鼠成纖維細胞( MEFs)、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)、人結直腸腺癌細胞(Caco-2)具有良好的細胞相容性,當濃度為1000μg/mL時,對人乳腺癌細胞(MCF-7)表現(xiàn)出潛在的細胞毒性。
　　以鹽酸阿霉素(Doxorubicin hydrochloride,DOX)為模型藥

6、物,通過離子交聯(lián)/聚電解質凝聚法結合透析的方法制備了包載 DOX的殼聚糖納米凝膠( DOX:CS-NGs)和包載 DOX的殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米凝膠(DOX:CS/CMCS-NGs),其平均粒徑分別為209.6 nm和279.3 nm;zeta電位分別為32.8 mv和-33.8 mv;DOX包封率分別為35.43%和72.87%;DOX包載量分別為14.9%和21.4%。利用透析法研究DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-N

7、Gs在連續(xù)的胃腸道模擬液中的釋藥行為,結果表明,在胃模擬液(pH1.2)中, DOX:CS-NGs的藥物釋放速率明顯高于 DOX:CS/CMCS-NGs,2 h內, DOX:CS-NGs和 DOX:CS/CMCS-NGs的藥物累積釋放率分別為32.4%和12.6%;隨著釋藥介質依次改變?yōu)槭改c模擬液(pH6.0,2 h),空腸模擬液(pH7.0,2 h),DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs的藥物釋放速率較慢且大致相同

8、,二者的藥物累計釋放率分別為,十二指腸模擬液:DOX:CS-NGs42.3%, DOX:CS/CMCS-NGs22.4%;空腸模擬液: DOX:CS-NGs61.2%, DOX:CS/CMCS-NGs38.7%,當釋藥介質改變?yōu)榛啬c/小腸上皮細胞間隙模擬液(pH7.4,2 h)后,DOX:CS-NGs和DOX:CS/CMCS-NGs的釋藥速率加快,其終點藥物累計釋藥率為87.6%和81.4%。以上結果表明,與DOX:CS-NGs相比,

9、DOX:CS/CMCS-NGs能夠有效降低藥物在胃酸環(huán)境下的突釋,將藥物定向輸送至小腸部位,在進入小腸上皮細胞間隙后釋放藥物。以小腸囊法分別研究了DOX:CS/CMCS-NGs和DOX:CS-NGs在大鼠不同腸段中的粘膜粘附性及通透,結果表明,DOX:CS/CMCS-NGs在十二指腸、空腸以及回腸部位能夠有效促進相應腸段對 DOX的粘附及吸收,其藥物透過率和粘附率分別為 DOX:CS-NGs的1-3.2倍和1.1–2.4倍。
　　

10、以傳統(tǒng)靜脈注射 DOX作為對照,分別對小鼠進行口服 DOX溶液、DOX:CS-NGs以及 DOX:CS/CMCS-NGs,研究了四種劑型的藥代動力學和組織分布,結果表明,DOX:CS/CMCS-NGs能夠有效提高DOX的口服生物利用度,其絕對生物利用度為42%,是口服的6倍DOX,口服DOX:CS-NGs的1.75倍?？诜﨑OX:CS/CMCS-NGs24 h后,在小鼠的肝臟、脾臟、肺部仍可檢測到DOX,且含量遠高于其他三種劑型,表明D

11、OX:CS/CMCS-NGs能夠顯著延長DOX在體內的循環(huán)時間。以小鼠為動物模型,通過分別在1d和15d兩次給藥的方式,研究了25天內靜脈注射 DOX、口服空白 CS/CMCS-NGs以及口服DOX:CS/CMCS-NGs的對小鼠的心腎臟毒性,測量小鼠的體重以及心腎重量和生化指標,結果表明,與傳統(tǒng)靜脈注射 DOX相比,口服 DOX:CS/CMCS-NGs能夠顯著減小DOX的心腎毒性。
　　利用 Caco-2細胞對雙熒光納米凝膠(C

12、y3-CS/FITC-CMCS-NGs)的攝取和轉運的方式和途徑進行了定性和定量研究,結果表明, Caco-2細胞對Cy3-CS/FITC-CMCS-NGs的攝取和轉運主要是一種主動運輸,主要通過網格蛋白介導的內吞方式進行。分別研究了CS、CMCS以及CS/CMCS-NGs在不同pH值環(huán)境下對鈣離子的螯合作用,結果表明,三種材料對鈣離子的螯合能力隨 pH值的升高而加強,其對鈣離子的螯合能力為CS/CMCS-NGs> CMCS> CS,表

13、明CS/CMCS-NGs對鈣離子具有的較高的螯合能力主要歸因于納米凝膠的3D結構中和 CMCS組分。利用 Caco-2致密單層構建小腸吸收模型,研究了DOX:CS/CMCS-NGs經細胞旁途徑透粘膜的機理,結果表明,納米凝膠的CS和CMCS組分均能夠可逆性降低 Caco-2致密單層的跨膜電阻( Transepithelial electrical resistance, TEER),使藥物經腸道通過細胞旁途徑進入體循環(huán),其中, CS降低

14、TEER的幅度隨pH的升高(pH6.6-pH7.4)而減小,而CMCS降低TEER的幅度隨pH值的升高(pH6.6-pH7.4)而增大。向DOX:CS/CMCS-NGs中加入鈣離子后,Caco-2的 TEER的降低幅度顯著減小,結合納米凝膠及其組分對鈣離子的螯合作用表明,DOX:CS/CMCS-NGs經細胞旁途徑透粘膜作用歸因于其CS和CMCS組分的協(xié)同作用,在弱酸性(pH<7)條件下,即十二指腸環(huán)境中,DOX:CS/CMCS-NGs中

15、質子化的CS組分能夠打開細胞間緊密連接,同時,部分去質子化的 CMCS組分能夠螯合鈣離子,打開細胞間粘合連接進而促進藥物通過細胞旁途徑進入體循環(huán);在中性及弱堿性條件(pH≥7)下,即空腸和回腸環(huán)境中,CS組分去質子化,打開細胞間緊密連接的能力減弱,而完全去質子化的CMCS組分螯合鈣離子能力增強,確保藥物的持續(xù)吸收。
　　采用離子交聯(lián)結合滴注法和乳化法的方式以將 DOX:CS/CMCS-NGs固定于多層海藻酸鈣膠球(Multilay

16、er alginate bead, M-ALG-Bead)中,得到載藥納米凝膠固定化多層球(NGs-M-ALG-Bead),利用響應面分析的方法優(yōu)化制備過程,結果表明,NGs-M-ALG-Bead對DOX的包封率與海藻酸鈉的濃度、氯化鈣濃度以及 DOX:CS/CMCS-NGs濃度有關而與多層球的層數(shù)無關,當海藻酸鈉的濃度為3.44%,氯化鈣濃度為3.23%,DOX:CS/CMCS-NGs濃度為0.3%時,得到最高的藥物包封率(97.21

17、%)。不同層數(shù)的 NGs-M-ALG-Bead的溶脹實驗及NGs-M-ALG-Bead在連續(xù)胃腸道模擬液中的釋藥動力學表明,4層的NGs-M-ALG-Beads在胃酸環(huán)境下最穩(wěn)定,其溶脹率和藥物累計釋放率分別5%和3.8%,有利于提高劑型在小腸部位處的有效濃度,而在小腸部位,隨著海藻酸鈉多層球的解體,完整的 DOX:CS/CMCS-NGs被逐漸釋放出來,有利于延長DOX:CS/CMCS-NGs與小腸上皮粘膜的接觸時間,提高小腸對藥物的吸

18、收效果,離體小腸粘附性和通透性實驗表明, NGs-M-ALG-Beads能夠有效提高DOX:CS/CMCS-NGs的粘膜粘附率和藥物通透率,分別為游離DOX:CS/CMCS-NGs的1.07-1.15倍和1.28-1.38倍。
　　本文以殼聚糖及其水溶性衍生物羧甲基殼聚糖為原料,制備了一種殼聚糖/羧甲基殼聚糖納米凝膠用于口服藥物的輸送。通過體外、體內實驗評估了該材料的粘膜粘附性、通透性以及生物安全性并研究了其透粘膜機理。通過將該納