RNA干擾技術(shù)調(diào)控青光眼術(shù)區(qū)纖維化的研究.pdf

1、目的：青光眼是以病理性高眼壓、進行性視神經(jīng)變性和視野缺損為特征的，位列全球第二位不可逆性致盲眼病。目前青光眼濾過性手術(shù)是治療青光眼的最主要手段之一，手術(shù)失敗的最主要原因為濾過道的疤痕化，隨著一些抗代謝藥物如5-Fu、MMC等的應用，抗青光眼濾過手術(shù)的成功率已大大提高，但隨之帶來一些不可避免的并發(fā)癥：濾過泡滲漏、低眼壓、眼球感染、低壓性眼病等等，嚴重影響了濾過性手術(shù)的效果，并進一步加重視功能損害。因此，尋找新的調(diào)控術(shù)區(qū)疤痕化同時又不影響創(chuàng)

2、口愈合的平衡調(diào)控方法是抗青光眼濾過性手術(shù)成功的關鍵。 本研究探討應用RNA干擾技術(shù)，特異性地抑制IKKB的表達，從而下調(diào)NF-κB的活性，降低細胞因子、生長因子的分泌，平衡調(diào)控青光眼術(shù)區(qū)創(chuàng)口愈合，提高手術(shù)的成功率的可行性、安全性、有效性及其作用機制。 方法 1、正常人眼球筋膜成纖維細胞的體外培養(yǎng)和鑒定：取正常供體新鮮的Tenon's囊組織，利用組織塊培養(yǎng)法，進行成纖維細胞體外培養(yǎng)，并利用光鏡、電鏡、細胞免疫組織化

3、學法鑒定人成纖維細胞； 2、設計、合成靶向IKKB基因的siRNAs，并進行篩選得到具有高效干擾效率的siRNA； 3、利用高效的轉(zhuǎn)染試劑HiperFectTransfectionReagent將siRNA轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的人成纖維細胞，并設有不同的轉(zhuǎn)染濃度(5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、200nM)進行RNA干擾，同時設有空白對照組、陰性對照組，然后用RT-PCR的方法檢測干擾后IKKB的mRNA表達水

4、平；用Westernblot的方法檢測IKKB的蛋白表達水平；用MTT法檢測RNA干擾后成纖維細胞增殖能力受到的影響，繪制其量效曲線；采用劃痕法檢測成纖維細胞的遷移能力； 4、采用激光共聚焦熒光顯微鏡檢測RNA干擾后NF-κB的活性，并采用RT-PCR的方法檢測其下游的生長因子：BFGF、CTGF和基質(zhì)金屬蛋白酶：MMP-2、MMP-9，探討其抑制成纖維細胞增殖的可能機制； 5、利用靈長類動物恒河猴制作青光眼濾過性手術(shù)模

5、型，并在手術(shù)同時進行siRNA體內(nèi)轉(zhuǎn)染術(shù)區(qū)筋膜組織，進行動物體內(nèi)的RNA干擾治療，同時設有MMC對照組、空白對照組。分別于轉(zhuǎn)染后1d，3d，7d，14d、21d、28d、42d進行眼壓測量，并于術(shù)后28d、42d時取標本進行術(shù)區(qū)組織病理學切片、Massion三色染色、天狼星紅染色偏振光檢測術(shù)后各組的膠原組織增殖情況。 結(jié)果 1、體外成功培養(yǎng)正常人眼球筋膜成纖維細胞，細胞呈長梭形，胞漿豐富，核大，生長能力強，呈旋渦樣或羽毛

6、樣生長，Vimentin染色陽性； 2、設計合成的siRNA經(jīng)篩選獲得1條較為高效的siRNA；體外培養(yǎng)的成纖維細胞經(jīng)RNA干擾后24小時，RT-PCR檢測顯示：IKKB的mRNA受到了抑制，抑制水平隨著轉(zhuǎn)染濃度的增大而增大，Westernblot的結(jié)果也說明IKKB的蛋白表達也受到了抑制，也具有濃度依賴性。 3、MTT法結(jié)果示：靶向RNA干擾抑制IKKB的表達后，體外培養(yǎng)的成纖維細胞的增殖受到限制，轉(zhuǎn)染濃度為5nM、1

7、0nM、25nM、50nM、100nM、200nM時的抑制率分別為10.7％、23.3％、30.8％、51.2％、50.1％、49.6％；劃痕法檢測也顯示成纖維細胞的遷移能力受到了抑制； 4、激光共聚焦熒光顯微鏡檢測示靶向RNA干擾抑制IKKB后，NF-κB的活性也受到了抑制； 5、RT-PCR檢測結(jié)果示：靶向RNA干擾抑制IKKB后，BFGF、CTGF、MMP-2以及MMP-9的表達均受到抑制； 6、在恒河猴濾

8、過性手術(shù)模型中，單純手術(shù)組的濾過泡存活3周，而RNA干擾組的濾過泡至少可以維持6周，結(jié)果與MMC相近似，但是沒有像MMC組那樣產(chǎn)生薄壁濾過泡，也沒有出現(xiàn)過低眼壓；病理組織學檢查發(fā)現(xiàn)單純手術(shù)組術(shù)后可見結(jié)膜下有大量的成纖維細胞增殖，結(jié)膜下有大量膠原纖維形成，小血管增生；而RNA干擾組在術(shù)后結(jié)膜下膠原組織增生較少，明顯比單純手術(shù)組稀疏，但是沒有像MMC組那樣稀薄，而且在手術(shù)后6周則有少量的纖維組織增殖。 結(jié)論 1、RNA干擾技

9、術(shù)可以高效地抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制蛋白激酶β(即IKKB)的表達，而且隨著siRNA的轉(zhuǎn)染濃度的升高而抑制程度增加。 2、靶向RNA干擾抑制IKKB的表達對體外培養(yǎng)的人眼球筋膜囊成纖維細胞的增殖有明顯抑制作用；抑制率隨著siRNA的轉(zhuǎn)染濃度的增大而增大，當siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為50nM時，達到了體外抑制的最大值。 3、靶向RNA干擾抑制IKKB的表達，能夠抑制體外培養(yǎng)的人眼球筋膜囊成纖維細胞的增殖的機制可能是：由于IKK

10、B受到抑制，因而NF-κB的活性也受到了抑制，進而影響了MMP-2，MMP-9的表達以及BFGF、CTGF等生長因子的表達、分泌。這些生長因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的減少就是成纖維細胞的增殖受到抑制的直接原因。 4、靶向RNA干擾抑制術(shù)后IKKB的表達，可以明顯抑制猴眼小梁切除術(shù)后濾過區(qū)成纖維細胞的過度增生，抑制術(shù)后術(shù)區(qū)的炎癥反應，抑制成纖維細胞合成與分泌膠原，從而獲得與MMC的作用相近似的抑制濾過區(qū)疤痕化的效果；沒有明顯的眼內(nèi)毒性，