5-Fu聯(lián)合塞來昔布對胃癌的抑制作用及機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　胃癌是世界上死亡率較高的疾病，且發(fā)現(xiàn)的時候大多數(shù)是進展期[1，2]，早期胃癌的5年生存率在70-75％左右[2]，但進展期的5年生存率只有35％。提高生存率是我們的主要治療目標(biāo)?；熓钱?dāng)前治療胃癌的主要手段之一[3]，盡管新的抗癌藥物及化療方案不斷推出，但治療效果仍無明顯進展，其主要原因就是胃癌細胞對化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥，從而使化療藥物的應(yīng)用受到明顯的限制。低氧環(huán)境是多種實體腫瘤包括胃癌的特征之一，低氧下發(fā)生化

2、療抵抗是腫瘤化療失敗的重要原因，多種化療藥物低氧下抗腫瘤作用減弱[4]。由于腫瘤的低氧微環(huán)境、腫瘤干細胞的存在等多種原因發(fā)生放化療抵抗、多藥耐藥，最終導(dǎo)致治療失敗。
　　5-Fu是一種抗代謝的化療藥物，是國內(nèi)外腫瘤臨床輔助化療和新輔助化療最常選用的藥物之一，它能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，從而阻斷脫氧尿苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账?，影響細胞DNA的合成導(dǎo)致細胞損傷和死亡[5]。臨床試驗表明包含5-Fu的化療方案能提高胃癌患者的生存率，但仍存

3、在局部治療的失敗和遠處轉(zhuǎn)移[3，6]。有研究結(jié)果表明，患者癌細胞內(nèi)低氧環(huán)境導(dǎo)致了耐藥性存在，降低了的5-Fu的療效[7,8]。
　　近年的研究認為，腫瘤組織中存在的腫瘤干細胞，是腫瘤產(chǎn)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥及放化療抵抗的主要原因[9，10]。研究腫瘤干細胞可以幫助我們更好的了解腫瘤的生物學(xué)特性和改善腫瘤的化療抵抗。但至目前，尚無法直接分離鑒定其中的干細胞，我們只能選擇跟腫瘤干細胞關(guān)系密切的某些標(biāo)志物來研究。
　　塞來昔布是非甾

4、體類抗炎藥的一種，是選擇性的環(huán)氧化酶2抑制劑，有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[11]，根據(jù)國內(nèi)外臨床及實驗研究表明，塞來昔布還具有抑制腫瘤的作用，但非甾體類抗炎藥抗腫瘤的確切機制尚不清楚[12-14]。
　　鑒于以上的研究結(jié)果，我們擬通過觀察5-Fu、塞來昔布以及它們的聯(lián)合用藥對體外生長的人胃癌細胞及對裸鼠人胃癌移植瘤的抑制作用，以及與腫瘤干細胞標(biāo)記物HIF-2α、ABCG2、OCT-4表達的關(guān)系，探討5-Fu與塞來昔布聯(lián)合應(yīng)用是否能通過降低人

5、胃癌細胞及裸鼠人胃癌移植瘤的干細胞標(biāo)記物HIF-2α、ABCG2、OCT-4的表達，從而改善和逆轉(zhuǎn)5-Fu的化療抵抗。
　　方法：
　　1. 體外實驗:將人胃癌細胞株SGC7901接種于RPMI1640培養(yǎng)液中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。化學(xué)缺氧劑CoCl2（濃度為150μmol/L）用于模擬腫瘤內(nèi)低氧微環(huán)境。取對數(shù)生長期的SGC7901細胞以2×105/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積為200μl。實驗分4組:低氧對照組、5-F

6、u組、塞來昔布組、聯(lián)合組。MTT法測定低氧下不同濃度的5-Fu、塞來昔布及聯(lián)合組分別對胃癌細胞的增殖抑制率，免疫細胞化學(xué)法、RT-PCR、Western-blot法觀察各組SGC7901細胞HIF-2α、ABCG2、 OCT-4的蛋白和mRNA的表達。
　　2. 體內(nèi)實驗:選用5-6周齡雄性裸鼠共28只，體重18-22g，取對數(shù)生長期的SGC7901人胃癌細胞懸液，無菌條件下將細胞懸液接種于裸鼠右腋皮下，繼續(xù)飼養(yǎng)2周，建立裸鼠荷瘤

7、模型。并將裸鼠分為4組:空白對照組、5-Fu組、塞來昔布組、聯(lián)合組。末次給藥后次日，處死動物，剖取瘤體組織，電子天平稱重瘤塊，計算各組抑瘤率，測量腫瘤的長短徑，計算腫瘤體積。免疫組織化學(xué)法、RT-PCR、Western-blot法觀察各組HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白和mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　1. 5-Fu聯(lián)合塞來昔布對體外SGC7901細胞的抑制作用:低氧環(huán)境下，不同濃度的5-Fu和塞來昔布呈劑量依賴性

8、的抑制SGC7901細胞增殖，接種后的細胞在48小時處于對數(shù)生長期，經(jīng)公式計算出5-Fu和塞來昔布對SGC7901細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別約為200mg/L、100μmol/L。低氧下半數(shù)抑制濃度的5-Fu、塞來昔布和聯(lián)合組作用于SGC7901細胞48小時后，其生長抑制率分別為52.61％、46.1％、66.09％，低氧下5-Fu、塞來昔布和聯(lián)合組都能抑制SGC7901細胞的增殖，但以聯(lián)合組抑制率最高，聯(lián)合組與其它組比較，差異

9、有統(tǒng)計學(xué)意義(F=35.237，P＜0.05)。
　　低氧對照組HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白呈較高水平表達，5-Fu組加入半數(shù)抑制濃度的5-Fu作用48小時，HIF-2α、ABCG2、 OCT-4mRNA及蛋白的表達進一步增加，但在塞來昔布組和聯(lián)合組均呈較低水平表達，5-Fu組、塞來昔布組、聯(lián)合組與低氧對照組兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(mRNA:HIF-2α F=819.242, ABCG2 F=515

10、.693, OCT-4 F=1929.264, P＜0.01。蛋白:HIF-2αF=4788.138, ABCG2 F=1739.794, OCT-4 F=25656.397,P＜0.01)。
　　2. 5-Fu聯(lián)合塞來昔布對裸鼠人胃癌移植瘤的抑制作用:5-Fu、塞來昔布和聯(lián)合組均能抑制裸鼠胃癌移植瘤的生長，但5-Fu組的平均瘤重及體積與對照組比較，差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），塞來昔布組和聯(lián)合用藥組瘤塊的平均瘤重及體積顯著小

11、空白對照組(P＜0.05)，且聯(lián)合用藥組顯著小于5-Fu組和塞來昔布組（P＜0.05），抑瘤率分別為26.36％、59.70％、88.37％，以聯(lián)合組抑瘤率最高，聯(lián)合組與5-Fu組、塞來昔布與5-Fu組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　空白對照組HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白呈較高水平表達，5-Fu組HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表達進一步增加，但在塞來昔布組和聯(lián)合組均呈較

12、低水平表達，5-Fu組、塞來昔布組、聯(lián)合組與對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1. 塞來昔布對低氧環(huán)境下體外生長的人胃癌SGC7901細胞和體內(nèi)生長的裸鼠人胃癌移植瘤均具有抑制作用，其機制可能與通過減少腫瘤細胞和腫瘤組織中干細胞標(biāo)記物HIF-2α、ABCG2、 OCT-4 mRNA及蛋白的表達有關(guān)。
　　2. 5-Fu與塞來昔布在體內(nèi)、體外聯(lián)合應(yīng)用均有協(xié)同抗腫瘤作用，其機制可能是通過減