塞來昔布聯(lián)合HMME-PDT對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用及機(jī)制的研究.pdf

1、隨著醫(yī)學(xué)的深入研究和經(jīng)驗(yàn)的積累，在癌癥的治療方面，盡管外科手術(shù)，放療，化療等傳統(tǒng)的治療方式取得了長足的進(jìn)步，然而治療效果仍不盡人意。近十年來腫瘤學(xué)的生物靶向治療蓬勃發(fā)展，但由于癌癥發(fā)生過程的復(fù)雜性，單獨(dú)治療模式往往效果不好，以分子機(jī)制為基礎(chǔ)的聯(lián)合作用有望取得更好的療效。 環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一種誘生性酶，受到各種細(xì)胞因子、生長因子及腫瘤活化因子等刺激后表達(dá)水平迅速升高，其主要功能是把花生

2、四烯酸轉(zhuǎn)變成前列腺素。COX-2在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，涉及細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成以及細(xì)胞免疫機(jī)制等方面。研究發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤包括肝癌、鼻咽癌、肺癌、大腸癌、前列腺癌及乳腺癌等都存在COX-2的高表達(dá)。因此COX-2可能成為惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。 體外研究證實(shí)COX-2特異性抑制劑能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在體條件下COX-2特異性抑制劑能抑制多種腫瘤的形成和／或轉(zhuǎn)移。但COX-2抑制劑

3、單獨(dú)作用對腫瘤的抑制效應(yīng)有限，用量過大增加其副作用，與其他療法聯(lián)合應(yīng)用有可能提高其抗腫瘤效應(yīng)。 光動力學(xué)療法(photodynamic therapy,PDT)是一種新型的腫瘤治療方法。它利用光敏劑分子接受特定波長的光能后通過光化學(xué)反應(yīng)和能量傳遞過程將光能轉(zhuǎn)化為分子內(nèi)能，在有氧條件下，產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)，包括單線態(tài)氧(1O2)、氧自由基、羥自由基等，從而破壞蛋白質(zhì)、核酸和

4、脂類等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。PDT獨(dú)特的優(yōu)勢是毒副作用非常小，能治療多種腫瘤且不易產(chǎn)牛耐藥性。研究顯示PDT治療腫瘤的過程中誘導(dǎo)了COX-2的表達(dá)，故給予COX-2抑制劑有可能提高PDT的治療效果。因此COX-2抑制劑聯(lián)合PDT成為目前研究的熱點(diǎn)。以往體內(nèi)外研究已經(jīng)部分證實(shí)COX-2特異性抑制劑可以顯著提高PDT的治療效果，這些研究所用到的光敏劑為Photofrin、5-ALA或Hypericin；所用到的光源為熒光燈、染料激

5、光器或鹵素?zé)?。而以血卟啉單甲?HMME)為光敏劑，發(fā)光二極管(LED)為光源的PDT聯(lián)合塞來昔布對CNE-2和HepG2細(xì)胞的研究還未見報(bào)道。 本課題擬采用CNE-2和HepG2細(xì)胞研究塞來昔布(celecoxib)聯(lián)合血卟啉單甲醚(HMME)介導(dǎo)的PDT對腫瘤細(xì)胞增殖的影響，MTT法取得塞來昔布的劑量、光敏劑的濃度及激光能量密度實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果，同時通過Annexin V／PI雙染法定量檢測凋亡率，流式技術(shù)觀察線粒體膜電位

6、的變化，Caspase-3試劑盒測定藥物作用前后caspase-3活性的變化，并采用免疫組化法檢測藥物處理后COX-2的表達(dá)變化情況，初步探討可能的作用機(jī)制。 方法： 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、單獨(dú)塞來昔布組(CNE-2：64～125μ M；HepG2：40.96～80μM)、單獨(dú)PDI、組(2.5 μg／ml HMME，0～0.5J／cm。)及塞來昔布聯(lián)合PDT組。將CNE-2和HepG2細(xì)胞分別分組處理后，MTT法檢測各組

7、作用24h后的抑制率。采用金氏公式評估聯(lián)合作用對腫瘤細(xì)胞的殺傷足否具有協(xié)同效應(yīng)，每種細(xì)胞各選出一組具有協(xié)同效應(yīng)的聯(lián)合模式用于以下試驗(yàn)的研究。 經(jīng)MTT法選出CNE-2細(xì)胞的聯(lián)合模式為：control、CX(80 μ M)、PDT(2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2)及CX+PDT；HepG2細(xì)胞的聯(lián)合模式為：control、CX(64μM)、PDT(2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2)及CX+PDT。

8、CNE-2和HepG2細(xì)胞經(jīng)以上聯(lián)合模式處理后觀察以下指標(biāo)：HE染色光鏡觀察、Hoechst 33342染色熒光顯微鏡觀察各組處理24h后細(xì)胞及細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化；Annexin V／PI雙染流式細(xì)胞儀檢測各組處理24h后的細(xì)胞凋亡率；Rhodamine 123染色流式細(xì)胞儀檢測各組處理6h后線粒體膜電位的變化情況；Caspase-3活性檢測試劑盒檢測各組處理16h后caspase-3酶活性的變化，并采用Bradford蛋白濃度測定試劑

9、盒測定蛋白濃度，caspase-3酶活性的結(jié)果用蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)化；免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各組處理24h后COX-2的表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，各數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.塞來昔布對CNE-2、HepG2細(xì)胞的抑制率呈劑量依賴性。64 μ M和80 μ M的塞來昔布對CNE-2細(xì)胞的抑制率分別是4.84％和13.23％，這兩個濃度的塞來昔布對HepG2細(xì)胞的

10、抑制率分別是17.17％和34.48％?？梢奌epG2細(xì)胞對塞來昔布更敏感。 光敏劑濃度為2.5μg/ml、光照射劑量分別為O．125 J／cm2、0.25 J／cm2和0.5J／cm2時，CNE-2和HepG2細(xì)胞的抑制率分別為13.76％、28.34％、39.5％和15.57％、25.14％、39.72％，說明HMME-PDT對兩種細(xì)胞的殺傷作用呈劑量依賴性，由數(shù)據(jù)可看出PDT對兩種細(xì)胞的增殖影響差別不大。 塞來昔布

11、和PDT聯(lián)合處理兩種腫瘤細(xì)胞，金氏公式分析聯(lián)合效應(yīng)的結(jié)果顯示：(1)對于CNE-2細(xì)胞，64 μ M和80μ M的塞來昔布與光敏劑濃度為2.5μg/ml、光照射劑量分別為0.125 J／cm2、0.25 J／cm2和0.5J／cm2的PDT組聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。其中80 μ M的CX組，2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2的PDT組以及兩者的聯(lián)合處理組的抑制率分別為13.23％、28.34％和44.57％，聯(lián)合處理組與單獨(dú)處理

12、組相比，抑制率有顯著差異(P<0.05)；(2)對于HepG2細(xì)胞，40.96 μ M、51.2 μ M和64μM的塞來昔布與光敏劑濃度為2.5μg／ml、光照射劑量為0.25J／cm2的PDT組聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。其中64 μM的CX組，2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2的PDT組以及兩者的聯(lián)合組的抑制率分別為17.17％、25.14％和44.87％，聯(lián)合處理組與單獨(dú)處理組相比，抑制率有顯著差異(p<0.05)。

13、2.HE染色光鏡觀察和Hoechst染色熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示80 μM或64 μM CX組、PDT組和CX+PDT組作用24h后CNE-2或HepG2細(xì)胞均發(fā)生明顯的形態(tài)變化，細(xì)胞呈凋亡或壞死樣改變，聯(lián)合處理組比單獨(dú)處理組更明顯。 3.流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，結(jié)果顯示80 μM的CX聯(lián)合2.5 μg／ml HMME+0.25J／cm2 PDT組可誘導(dǎo)CNE-2細(xì)胞發(fā)生凋亡和壞死，細(xì)胞凋亡率可達(dá)55.6％；64μM的CX聯(lián)合2.5

14、 μg／ml HMME+0.25J／cm2 PDT組誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡率達(dá)50.8％。 4.免疫細(xì)胞學(xué)染色結(jié)果顯示對照組細(xì)胞CNE-2和HepG2均表達(dá)COX-2，HMME-PDT處理后未發(fā)現(xiàn)CNE-2和HepG2細(xì)胞COX-2表達(dá)的增強(qiáng)。塞來昔布組和聯(lián)合處理組COX-2的表達(dá)顯著下調(diào)。 5.流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位，對于CNE-2細(xì)胞，80 μM CX、PDT及CX+PDT處理組作用6h后單獨(dú)CX和PDT組膜電

15、位均明顯下降，聯(lián)合組比單獨(dú)處理組下降更明顯。而HepG2細(xì)胞，64 μM的CX組作用6h后膜電位顯著下降，6h后PDT組輕微下降，聯(lián)合組比單獨(dú)CX組下降更明顯。 6.80μM或64μM CX、PDT及CX+PDT處理CNE-2或HepG2細(xì)胞后，caspase-3的表達(dá)不同程度的上調(diào)，以聯(lián)合用藥組最明顯。 結(jié)論： 1.塞來昔布和HMME-PDI單獨(dú)作用對CNE-2、HepG2細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，這種抑制作用