STAT6基因克隆及對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的：支氣管哮喘是一種發(fā)病率高，嚴(yán)重危害人們身體健康的慢性疾病，其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)為氣道炎癥的形成，多種細(xì)胞因子相互作用并形成網(wǎng)絡(luò)在慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用，而大多數(shù)細(xì)胞因子可通過細(xì)胞內(nèi)JAK-STAT途徑傳遞信息，引起靶細(xì)胞反應(yīng)。在哮喘慢性炎癥過程中起到重要作用的Th2細(xì)胞的分化、IL-4誘導(dǎo)的基因的激活及IgE的產(chǎn)生均是通過來信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6)實(shí)現(xiàn)的。由變應(yīng)原誘導(dǎo)STAT6的持續(xù)活化、過度表達(dá)，可促進(jìn)Th

2、2細(xì)胞的募集、增殖和優(yōu)勢(shì)表達(dá)IL-4、IL-13等細(xì)胞因子，抑制了IL-12等Th1型細(xì)胞的功能及其細(xì)胞因子，使Th1/Th2比例失衡。STAT6可促使T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，同時(shí)在IgE的產(chǎn)生及IL-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，是變態(tài)反應(yīng)性哮喘病理生理過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，目前已成為哮喘基因治療的新靶點(diǎn)。糖皮質(zhì)激素(GC)作為目前防治哮喘最有效的藥物，不僅可以抑制氣道的炎癥反應(yīng)，還能通過減少促炎因子的釋放，部分抑制氣道膠原纖維沉積

3、，影響氣道重塑。目前關(guān)于STAT6在氣道上皮細(xì)胞及T細(xì)胞作用文獻(xiàn)較多，但有關(guān)STAT6在成纖維細(xì)胞表達(dá)以及STAT6與氣道重塑報(bào)道較少。試圖通過克隆STAT6基因、轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞，以探討STAT6轉(zhuǎn)錄因子對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響，以及激素對(duì)STAT6核移位及STAT6轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞增殖的影響，以闡明STAT6在氣道重塑中的作用機(jī)制。綠色熒光報(bào)告基因標(biāo)記系統(tǒng)是一種新的基因及蛋白檢測(cè)方法，在研究基因表達(dá)調(diào)控中具有一定運(yùn)用前景。綠色熒光蛋白(G

4、FP)是一種新的標(biāo)記基因，對(duì)細(xì)胞無毒性，不影響與其連接的目的基因的表達(dá)，也不影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。在組織和細(xì)胞中，能耐受各種處理而保持其發(fā)光特性。選擇了GFP作報(bào)告基因，主要通過酶切位點(diǎn)和閱讀框的分析選擇了pEGFP-C1載體。通過構(gòu)建攜帶STAT6及綠色熒光報(bào)告基因的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒并檢測(cè)其在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，以尋找一種研究STAT6的新方法，同時(shí)研究IL-4、BUD對(duì)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞的影響。 方法：

5、 第一部分：采用PCR技術(shù)，從cDNA文庫中釣取并擴(kuò)增STAT6基因全長(zhǎng)作為目的基因，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切后，酶切產(chǎn)物膠回收，通過PCR產(chǎn)物的粘端克隆法，用T4連接酶將酶切后的STAT6定向克隆入相同限制性內(nèi)切酶雙酶切處理的pEGFP-C1載體的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建pEGFP-C1-STAT6重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳檢測(cè)、PCR陽性克隆鑒定及序列分析。 第二部分：利用GenePORTER 2

6、 Transfection試劑盒，將構(gòu)建好的pEGFP-C1-STAT6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞，24小時(shí)后激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)pEGFP-C1-STAT6融合蛋白在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞分四組，對(duì)照組、僅IL-4刺激組、BUD干預(yù)組、BUD預(yù)處理組，分別加入IL-4、IL-4+BUD，刺激前及刺激后(0min,30min,60min)分別用激光共聚焦顯微鏡觀察。IL-4、BUD處理后，轉(zhuǎn)染STAT6的成纖

7、維細(xì)胞用免疫組化染色的方法，觀察細(xì)胞增殖情況。圖像采用美國Media Cybernetics公司Image-Pro Plus圖像分析軟件(Version 4.5)，連續(xù)取10個(gè)放大倍數(shù)為200倍的視野，對(duì)片中免疫組化染色的陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，計(jì)算每視野陽性染色的積分光密度(integral optical density，IOD)值，取10個(gè)視野IOD值的均值為各組最終數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS12.0軟件作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，進(jìn)行單因素方

8、差分析(ANOVA)和多個(gè)樣本均數(shù)之間的多重比較(SNK q法)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1、用EcoR I、Kpn I雙酶切pEGFP-C1真核熒光表達(dá)載體和STAT6的PCR產(chǎn)物，分別可得到4.7kb的線性片段和2544bp的DNA片段，大小均與預(yù)期結(jié)果一致。PCR鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-C1-STAT6，通過PCR產(chǎn)物電泳，結(jié)果顯示第8、13泳道重組質(zhì)粒pEGFP-C1-STAT6有特異性擴(kuò)增

9、產(chǎn)物，與陽性對(duì)照組一致，其長(zhǎng)度約為802bp，空載體pEGFP的PCR結(jié)果為陰性。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序證實(shí)目的基因STAT6正確連接至pEGFP-C1的多克隆位點(diǎn)，質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2、pEGFP-C1-STAT6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到綠色熒光，熒光主要位于胞漿內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)有少許表達(dá)。通過激光共聚焦顯微鏡可以觀察到IL-4刺激組核移位明顯，STAT6轉(zhuǎn)錄因子大量聚集在細(xì)胞核內(nèi)，在30、60分鐘細(xì)胞

10、核因STAT6明顯增亮。BUD干預(yù)組STAT6轉(zhuǎn)錄因子在30、60分鐘細(xì)胞核內(nèi)仍有聚集，細(xì)胞核增亮。而BUD預(yù)處理組，用IL-4刺激后，30、60分鐘細(xì)胞核中STAT6熒光強(qiáng)度與IL-4刺激組無顯著差異。經(jīng)免疫組化染色后，熒光顯微鏡觀察到IL-4刺激組成纖維細(xì)胞增殖明顯，胞漿中BrdU強(qiáng)陽性表達(dá)，與BUD干預(yù)組和BUD預(yù)處理組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，<0.05)。BUD干預(yù)組和BUD預(yù)處理組成纖維細(xì)胞增殖不明顯，BrdU有

11、表達(dá)。但BUD干預(yù)組和BUD預(yù)處理組比較，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.453，>0.05)。 結(jié)論： 1、成功克隆了STAT6基因，并構(gòu)建了攜帶STAT6及綠色熒光報(bào)告基因的融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切及測(cè)序檢測(cè)結(jié)果可靠。 2、成功轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-STAT6重組質(zhì)粒，并在成纖維細(xì)胞中獲得表達(dá)，為STAT6基因的深入研究提供了新技術(shù)方法及理論依據(jù)。 3、IL-4能夠誘導(dǎo)STAT6核移位，BUD不能有