小麥Puroindoline A基因人工突變體的構(gòu)建、表達、抗菌活性分析及其在小麥中的功能研究.pdf

1、小麥籽粒硬度是小麥的最重要的目標性狀之一,它直接決定小麥的磨粉品質(zhì)和烘烤品質(zhì),是小麥品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標。在控制籽粒硬度Ha位點的三個基因中,Puroindoline(Pina)和Puroindoline(Pinb)是主效基因,編碼相對分子量13kDa的強堿性蛋白——PINA和PINB蛋白。這兩種PIN蛋白同時存在于小麥胚乳和糊粉層細胞中,并結(jié)合在胚乳淀粉粒的表面,大量存在于成熟種子中。PIN蛋白還能夠有效抑制許多植物病原菌的生長,對革蘭

2、氏陰性菌,革蘭氏陽性菌以及真菌具有明顯的抗性,并且PINA蛋白的抗菌作用強于PINB蛋白。
　　細菌對抗抗生素的途徑主要是通過表達特定的抗性基因分解抗生素,PIN蛋白則主要通過破壞特定脂質(zhì)成分的病原菌質(zhì)膜發(fā)揮抗菌能力,因此植物抗菌蛋白有望解決病原菌抗藥性問題,具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?br>　　成熟的PIN蛋白具有四個α-螺旋為主的二級結(jié)構(gòu),五對二硫鍵把整個分子結(jié)構(gòu)聚合成緊密的球型。前兩個α-螺旋之間存在一個含多個疏水Trp殘基和堿性

3、Lys、Asp殘基的色氨酸結(jié)構(gòu)域(TRD),很多證據(jù)證明TRD與其控制籽粒硬度和抗菌功能緊密相關(guān)。
　　本研究構(gòu)建了含多個色氨酸結(jié)構(gòu)域的Pina基因人工突變體ABBC和ABBBC,以期獲得抗菌性更強的植物蛋白,同時探索PIN蛋白決定籽粒硬度的分子機理;通過二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測,探索和推測PINA兩個突變蛋白的分子結(jié)構(gòu)。
　　利用PCR技術(shù),成功地擴增了小麥Pina基因并構(gòu)建了其含有不同色氨酸結(jié)構(gòu)域(TRD)的人工突變體A

4、BBC和ABBBC,并將其整合到到原核表達載體pET43.1a中,實現(xiàn)了在原核表達菌株Rosetta-gami(DE3)中的高效可溶性表達。采用Ni-NTA親和層析技術(shù),獲得了高純度和高濃度的PINA、ABBC和ABBBC重組蛋白。通過最低抑菌濃度的測定和熒光顯微鏡計數(shù)評估了重組蛋白的抗菌性變化。結(jié)果表明ABBC重組蛋白的抗菌性均明顯高于PINA重組蛋白(P<0.05),其可能成為有潛在的高效抗菌蛋白。而ABBBC重組蛋白的抗菌性均低于

5、PINA重組蛋白,無明顯的應(yīng)用價值。這一結(jié)果表明,通過增加TRD的方式可以提高PINA蛋白抗菌性,但是當TRD數(shù)量達到3個拷貝時,抗菌性能反而下降。
　　成功將Pina/ABBC/ABBBC構(gòu)建到真核表達載體pLRPT中,通過金粉包裹,基因槍轟擊,轉(zhuǎn)化入四倍體小麥Ofanto中,經(jīng)過誘導(dǎo)培養(yǎng),分化培養(yǎng),篩選培養(yǎng),春化培養(yǎng)和盆栽培養(yǎng),獲得轉(zhuǎn)基因后代。使用PCR檢測,SouthernBlot檢測,SDS-PAGE檢測以及Western