小麥磨粉品質(zhì)相關(guān)基因pina人工突變體的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、PIN蛋白是非常重要的品質(zhì)蛋白，包括兩種同源性很高的蛋白PINA和PINB，PIN蛋白直接決定小麥的籽粒硬度，并且具有天然的抗菌特性。編碼這兩個(gè)蛋白的基因pina和pinb位于5DS上，它們具有特殊的多色氨酸結(jié)構(gòu)域，推測(cè)其與PIN蛋白的功能密切相關(guān)。為了驗(yàn)證色氨酸結(jié)構(gòu)域與PIN蛋白功能之間的關(guān)系，我們構(gòu)建了含不同數(shù)量色氨酸結(jié)構(gòu)域的pina人工突變體，本研究在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了pina基因人工突變體的真核表達(dá)載體，并以硬粒小麥Ofanto為試

2、驗(yàn)受體材料，運(yùn)用基因槍法，將外源Pina基因的人工突變體ABBC和ABBBC轉(zhuǎn)入到不含pina基因的四倍體硬粒小麥Ofanto中，并運(yùn)用PCR和SDS-PAGE的方法對(duì)Ofanto轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行分子鑒定。研究結(jié)果如下：
　　 （1）以植物表達(dá)載體pLRPT為基礎(chǔ)，構(gòu)建了以胚乳特異表達(dá)啟動(dòng)子1Dx5驅(qū)動(dòng)的Pina基因突變體的真核表達(dá)載體pLRPT-ABBC和pLRPT-ABBBC，并運(yùn)用基因槍的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化硬粒小麥Ofanto幼嫩

3、盾片。
　　 （2）對(duì)組培條件進(jìn)行優(yōu)化，并使用優(yōu)化后的條件進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得800余株再生苗。
　　 （3）根據(jù)pina基因的序列，設(shè)計(jì)合適的PCR引物，探索并優(yōu)化PCR條件，運(yùn)用PCR的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行鑒定，并篩選到13株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。
　　 （4）采用優(yōu)化的SDS-PAGE方法，對(duì)PCR檢測(cè)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株后代PINA突變體蛋白的表達(dá)進(jìn)行了分析，共獲得外源基因正確表達(dá)植株8株。
　　 本實(shí)驗(yàn)所得到